タンパク質電気泳動

電気泳動法は外部から電場をかけて荷電分子を移動させる方法で、核酸、タンパク質などの分離分析に広く用いられています。タンパク質の電気泳動分析では、ポリアクリルアミドゲル電気泳動(PAGE)が汎用されています¹⁾。中でも分子量測定やタンパク質の精製過程での純度の検定などにはSDS-PAGEがよく用いられます。ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)は強力なタンパク質変性剤で、SDS-PAGEでは試料やゲル、電極緩衝液に添加されます。SDSはタンパク質を変性させるとともにタンパク質と結合します。この際、2-メルカプトエタノールなどの還元剤によってS-S結合を切断し、タンパク質を完全に変性させることによって、タンパク質分子全体をほぼ均一に負電荷を帯びた状態にすることができます。これを電気泳動すると、原則としてタンパク質の形や性質に関わらず分子量にしたがって分離することができます。

SDS-PAGEの中で最も多く利用されているのがLaemmli法²⁾です。Laemmli法では、ゲル中はトリス-塩酸、泳動用緩衝液はトリス-グリシンを用いてSDS存在下で泳動を行います。塩化物イオンとグリシンイオンによってバンドがシャープになるのが特徴です¹⁾。

ゲル調製用試薬および緩衝液調製用試薬など

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SDS-PAGEサンプルバッファー

サンプル量によって使い分けが可能な、3種類の濃度のサンプルバッファーを取り揃えています。還元剤は含まれていないため適宜添加する必要があります。赤色のサンプルバッファーもあり、サンプルによって色を使い分けることができます。

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SDS-PAGEサンプルバッファーの利用例

上記の各サンプルバッファーを使用して、泳動サンプルを調製しアクリルアミドゲルにアプライした。

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還元剤を添加するSDS-PAGEサンプルの調製手順動画

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ゲル染色試薬１（安全で高感度にタンパク質を検出できる銀染色キット）

電気泳動後のポリアクリルアミドゲルに含まれるタンパク質のバンドを検出するためには、ゲルを染色する必要があります。一般的な染色方法としては、銀染色、ネガティブ染色、クマシーブリリアントブルー染色、蛍光染色があります。
銀染色は、ポリアクリルアミドゲル電気泳動後のタンパク質やDNAを染色する代表的な手法です³⁾ 。銀イオンがゲル中のタンパク質やDNAに結合し、還元されることで銀染色像が得られます⁴⁾。銀染色はクマシーブリリアントブルー（CBB）染色よりも高感度であり、数ngのタンパク質を検出することができます。また、1時間程でゲル内のタンパク質やDNAを染色可能です。 銀染色キット（製品コード：I1309）はアンモニウム不含であり、爆発性の銀アミドを生じないので安全にご使用いただけます。

利用例（I1309によるゲルの染色）

1. 付属の溶液を100倍希釈し、固定液、染色液、現像液、停止液を調製する。
2. 固定液を入れたトレーに電気泳動後のゲルを入れ、10分間振とうさせる。
3. 固定液を捨て、脱イオン水を加えて10分間振とうさせる（3回繰り返す）。
4. 脱イオン水捨て、染色液を加えて5分間振とうさせる。
5. 染色液を捨て、脱イオン水を加えて30秒間振とうさせる。
6. 脱イオン水を捨て、現像液を加えて30秒間振とうさせる。
7. 現像液を捨て、新たな現像液を加えて適切な染色像が得られるまで振とうさせる（5～10分間程度）。
8. 現像液を捨て、停止液を加えて10分間振とうさせる。
9. 停止液を捨て、脱イオン水を加えて5分間振とうさせる（3回繰り返す）。

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ゲル染色試薬２（短時間で高感度にタンパク質を検出できるゲルネガティブ染色キット）

ネガティブ染色とは、タンパク質のバンドが透明なまま、バンド以外のゲル部分を白く染色する方法です⁵⁾。染色後のゲルは黒い背景の上に置くことで、バンドを明確に目視することができます。
ゲルネガティブ染色キットを用いると、20分程度で高感度にタンパク質のバンドを検出することが可能です。また、キットに付属する脱色液を使用することで簡単にゲルの脱色が可能で、脱色後のゲルはウエスタンブロッティングや質量分析に使用することができます^6,7)。

利用例（G0615によるゲルの染色）

1. ゲルが浸る程度の脱イオン水を入れたトレーにSDS-PAGE後のゲルを入れ、10分間振とうする。
2. 脱イオン水を捨て、脱イオン水で10倍希釈したA液をゲルが浸る程度加え、5分間振とうする。
3. A液を捨て、ゲルが浸る程度の脱イオン水を加えて10秒間洗浄する。この操作を3回繰り返す。
4. ゲルを新しいトレーに移し、脱イオン水で10倍希釈したB液をゲルが浸る程度加えて1分間振とうし、発色させる。

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利用例（ウエスタンブロッティングへの応用）

1. 脱イオン水で10倍希釈したC液が入ったトレーに、染色・撮影後のゲルを入れる。
2. ゲルの色が抜けるまで振とうする。
3. C液を捨て、ゲルが浸る程度の脱イオン水を加えて30秒間洗浄する。この操作を3回繰り返す。
4. 洗浄後のゲルをメンブレン（PVDF）に転写する。

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ゲル染色試薬３（メタノールフリーのCBB染色液）

C3488は酢酸、メタノールを含まない一液タイプの調製済みタンパク質染色用溶液です。ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行った後に、ゲルをC3488に浸すだけでタンパク質の染色が行えます。

利用例（C3488によるゲルの染色）

1. 電気泳動後のゲルを脱イオン水で5分間洗浄する。これを3回繰り返す。
2. 洗浄した水を捨てC3488をゲルが浸る程度加え、60分間室温で振とうする。
3. C3488を捨て脱イオン水で60分間洗浄後に、観察する。バックグラウンドが高い場合は、脱イオン水で一晩洗浄する。

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銀染色、ネガティブ染色、CBB染色の比較

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タンパク質染色試薬およびその他の関連試薬

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DNAの電気泳動

アガロースゲルを使用した電気泳動はDNAを分離・分析する方法として広く使われています。DNAを構成するヌクレオチドはリン酸基により負の電荷を帯びています。そのため、アガロースゲルにDNA試料を添加し、電気を流すとDNAは陽極側に引き寄せられて移動していきます。アガロースゲルの網の目の隙間をDNAが移動する際に、分子量の大きな長い分子は移動速度が遅く、小さいものは速く移動します。この原理を利用してDNAを分子の大きさで分離する方法がアガロースゲル電気泳動です⁸⁾。

電気泳動用核酸サンプル調製試薬

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核酸染色試薬（エチジウムブロミド溶液）

エチジウムブロミドはアガロースゲルの染色剤として広く利用されており、高感度にDNAを検出することができます⁹⁾。しかし、発がん性を有すること⁶⁾やUVトランスイルミネーターなどの専用の検出器が必要といった問題点があります。Ethidium Bromide (0.5mg/mL in Water)は調製済みの臭化エチジウムがドロッパーボトルに入っているため、安全かつ簡単に染色液を調製できます。

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利用例（E1363によるゲルの染色）

1. 電気泳動後、水もしくは泳動バッファー 40mLあたりE1363を1滴（終濃度0.5μg/mL）滴下し、染色液を準備する。
2. 適切な容器に移した染色液とアガロースゲルを浸漬し15分間染色する。バックグランドが高い場合は、水でさらに15分間洗浄する。（泳動バッファーおよびゲルにあらかじめ 0.5μg/mLとなるようエチジウムブロミドを添加しておくと、泳動後すぐにバンドの観察ができる。）
3. UVトランスイルミネーターで観察する。

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核酸染色試薬（核酸ステインブルー）

核酸ステインブルーは、アガロースゲル電気泳動後の核酸を染色するために使用できます。核酸を青く染色するため、トランスイルミネーター等の検出装置は不要です。エチジウムブロミドとは異なり、非変異原性であるため、安全性が高く取り扱いが容易です。

利用例（N1209によるゲルの染色）

1. 脱イオン水で10倍希釈したN1209を用意する。
2. 電気泳動後のゲルを、希釈したN1209に浸して10分間振とうする。
3. 染色液を捨て脱イオン水で30分間振とうし、ゲルを洗浄バックグラウンドが高い場合は、この操作を繰り返す。

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製品パンフレット

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関連製品カテゴリーページ

• タンパク質電気泳動

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引用文献

• 1) J. Sambrook, D. W. Russell, in Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 3rd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, 2001.
• 2) Cleavage of Structural Proteins during the Assembly of the Head of Bacteriophage T4
  • U. K. Laemmli, Nature 1970, 227, 680.
• 3) DEVELOPMENT AND MECHANISMS OF SILVER STAINS FOR ELECTROPHORESIS
  • C. R. Merril, Acta Histochem. Cytochem. 1986, 19, 655.
• 4) Detection of Proteins in Polyacrylamide Gels by Silver Staining
  • M. J. Dunn, in The Protein Protocols Handbook, ed. by J. M. Walker, Humana Press, Totowa, 2009, 227, pp 521.
• 5) Understanding the mechanism of the zinc-ion stains of biomacromolecules in electrophoresis gels: Generalization of the reverse-staining technique
  • C. Fernandez-Patron, L. Castellanos-Serra, E. Hardy, M. Guerra, E. Estevez, E. Mehl, R. W. Frank, Electrophoresis 1998, 19, 2398.
• 6) A procedure for protein elution from reverse-stained polyacrylamide gels applicable at the low picomole level: An alternative route to the preparation of low abundance proteins for microanalysis
  • L. R. Castellanos-Serra, C. Fernandez-Patron, E. Hardy, V. Huerta, Electrophoresis 1996, 17, 1564.
• 7) High Yield Elution of Proteins from Sodium Dodecyl Sulfate–Polyacrylamide Gels at the Low-Picomole Level. Application to N-Terminal Sequencing of a Scarce Protein and to In-Solution Biological Activity Analysis of On-Gel Renatured Proteins
  • L. R. Castellanos-Serra, C. Fernandez-Patron, E. Hardy, H. Santana, V. Huerta, J. Protein Chem. 1997, 16, 415.
• 8) Agarose Gel Electrophoresis for the Separation of DNA Fragments
  • P. Y. Lee, J. Costumbrado, C.-Y. Hsu, Y. H. Kim, J. Vis. Exp. 2012, 62, 3923.
• 9) Detection of DNA in Agarose Gels
  • J. Sambrook, D. W. Russell, in Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 3rd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, 2001, vol. 1, Chap. 5, 14.

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