Verslag lac-operon CBI
Cell Biology (CBI-10306)
Wageningen University & Research
Aanbevolen voor jou
Reacties
Preview tekst
De genexpressie van het Lac-
operon in de bacterie E
afkomstig uit verschillende
groeicondities
Geschreven door: Vibeke Timmenga
Reviewed door: Gwen Snijders
Inleiding
Vrijwel alle cellen in een organisme bevatten hetzelfde DNA. Toch zijn er grote verschillen in vorm en functie tussen verschillende typen cellen. Deze verschillen vinden hun oorsprong in differentiële genexpressie. Dit wil zeggen dat sommige genen tot expressie komen, waarbij mRNA moleculen gevormd worden, die vervolgens vertaald worden in eiwitten. Andere genen komen op dat moment niet tot expressie, en de eiwitten waarvoor deze genen coderen worden dus niet gevormd (Alberts et al. 2019).
De vorming van eiwitten op basis van de volgorde van nucleotiden in genen verloopt via de processen transcriptie en translatie. Transcriptie is het proces waarbij DNA wordt overgeschreven naar mRNA. Translatie is het vertalen van mRNA tot een eiwit. Welke genen tot expressie komen hangt af van vele factoren, zoals de leeftijd van een cel of organisme en de omgeving van een cel. Milieufactoren, zoals beschikbaarheid van voedingstoffen, zijn medebepalend voor de expressie van genen (Alberts et al. 2019)
In bacteriën zoals Escherichia coli (E. coli) hebben milieufactoren, zoals de aanwezigheid van verschillende energiebronnen, ook invloed op de genexpressie. E. coli kan zowel glucose als lactose gebruiken als energiebron. Lactose is een disacharide die kan worden omgezet in glucose en galactose (Figuur 1). De omzetting van deze disacharide is met name belangrijk om in de energiebehoefte van de bacterie te voorzien wanneer glucose afwezig is. De reactie wordt in E. coli gekatalyseerd door het enzym ß-galactosidase (Alberts et al. 2019).
Figuur 1: De omzetting van lactose in glucose en galactose door het enzym ß-galactosidase (Splunter et al. 2022a)
Het gen dat codeert voor het enzym ß-galactosidase ligt in het Lac-operon. Een operon is een set genen die gereguleerd wordt door dezelfde promoter. Wanneer een operon tot expressie komt, leidt dit tot de vorming van één mRNA molecuul dat informatie bevat voor de vertaling van meerdere eiwitten. Behalve het ß-galactosidase gen (lacZ), bevat het Lac-operon nog twee genen die coderen voor eiwitten betrokken bij het metabolisme van lactose, lacY en lacA (Splunter et al. 2022b). Buiten het Lac-operon bevindt zich een vierde gen, lacI, dat codeert voor de Lac-repressor (Figuur 2). Het lacI-gen bevat haar eigen promoter en komt altijd tot expressie (Alberts et al., 2019).
Figuur 2: Het lac-operon bevat meerdere genen die betrokken zijn bij de afbraak van lactose. Figuur van Biocoach © Savvas Learning Company LLC, or its affiliates. Used by permission. All Rights Reserved.
Tijdens het practicum hebben we onderzocht wanneer het lac-operon genexpressie
vertoonde. We hebben gebruik gemaakt van E. coli, gekweekt onder verschillende condities, op verschillende koolstofbronnen (lactose en glucose).
Door de substraatomzetting van ß-galactosides te meten konden we de enzymactivititeit van ß-galactosidase analyseren. Bij een hoge substraatconcentratie zal de snelheid van deze reactie namelijk evenredig zijn aan de hoeveelheid ß-galactosidase in de cel.
Materiaal en Methoden
Resultaten
De volgende celpreparaten zijn van links naar rechts (onder het kopje incubatie figuur 1) in de resultaten weergegeven: glucose, lactose, glucose na groei in aanwezigheid van lactose, glucose + lactose en glucose na groei in aanwezigheid van lactose
incubatie glucose lactose glucose na gr glucose + lacglusose na grcontrole (Na tijd 0 0,065 0,081 0,085 0,073 0,043 0, 30 0,058 1 0,72 0,479 0,049 0, 60 0,049 1 2 0,891 0,043 0, 90 0,052 3 0,049 0,
Figuur 1: adsorptiewaarden op verschillende momenten over de tijd bij verschillende kweekcondities (ongecorrigeerd)
Figuur 1 geeft de (ongecorrigeerde) waardes van de adsorptie van E, afkomstig uit verschillende kweekcondities. Duidelijk is, dat alle E gekweekt in condities met een aanwezigheid van glucose, een lagere adsorptiewaarde toonde. Andersom kende de E gekweekt onder omstandigheden waar lactose aanwezig was, een resultaat met hogere adsorptiewaardes. Een aantal gegevens missen, door een fout die in de meting in het experiment is gemaakt. Deze hebben verder geen invloed op de conclusies die ik heb getrokken in dit verslag.
y = 3E-05x + 0,
y = 0,0247x + 0, y = 0,0262x - 0,
y = 0,0138x + 0,
0 10 20 30 40 50 60 70 80 y = 0,0002x - 0,0121 90 100
adsorbtie
glucose glucose + lactose lactoseglusose na groei aanwezigheid lactose en chlooramphenicol Tijd (minuten) glucose na groei aanwezigheid lactoseLinear (glucose) Linear (lactose) Linear (lactose) Linear (lactose)Linear (glucose na groei aanwezi gheid lactose) Linear (lactose)Linear (glucose na groei aanwezi gheid lactose) Linear (glucose na groei aanwezigheid lactose) Linear (glucose + lactose) Linear (glusose na groei aanwezigheid lactose en chlooramphenicol)
Figuur 2: adsorptie uitgezet tegen de tijd bij verschillende kweekcondities
Figuur 2 toont de adsorptie als functie van de tijd, weergegeven door een trendlijn. De helling geeft ons informatie over de adsorptiesnelheid, die gelijk is aan de enzymactiviteit, mits voldoende substraat aanwezig (Splunter van et al., 2022). Voor ons experiment is dat het geval. Logischerwijs zien we ook hier de grootste enzymactiviteit bij de kweekcondities waar lactose aanwezig is. Louter bij de kweekcondities glucose en glucose na groei in aanwezigheid van lactose en chlooramphenicol, zagen we geen toename van de trendlijn.
0
0,
0,
0,
0,
0,
0,
glucose lactose glucose na groei aanwezigheid lactose
glucose + lactose glusose na groei aanwezigheid lactose en chlooramphenicol
enzymactivitieit
Figuur 3: enzymactiviteit bij E afkomstig uit verschillende kweekcondities
Voor figuur 3 zijn de hellingsgetallen, gelijk aan de enzymactiviteit (adsorptiesnelheid) van ß-galactosidase, weergegeven in een staafdiagram. Hier krijgen we een overzichtelijk beeld van de resultaten uit figuur 1 en 2.
Discussie Als we opnieuw naar het lac-operon kijken, zien we dat het LacI gen verantwoordelijk is voor de synthese van de repressor (Splunter van et al., 2022). Deze bindt aan de operator, zodat het operon niet door RNA-polymerase afgelezen kan worden. Komt het operon wel tot expressie, dan wordt het enzym ß-galactosidase gevormd en kan lactose worden afgebroken.
Uit de resultaten konden we concluderen dat bij aanwezigheid van lactose in het kweekmedium de enzymactiviteit het hoogst was. Dit zou moeten betekenen dat de repressor geen kans kreeg om te binden aan de promotor en lactose hier verantwoordelijk voor was. Allactose, de isomeer van lactose die wordt gevormd, noemen we daarom een ‘inducer’, een molecuul dat bindt aan de repressor en zo de genexpressie mogelijk maakt (Splunter van et al., 2022).
De aanwezigheid van cyclisch AMP (CAMP) speelde ook een belangrijke rol in de genexpressie van het lac-operon. CAMP bindt zich namelijk aan het cataboliet activatie eiwit, dat zich voor de repressor bevindt, en bevordert zo de genexpressie (Splunter van et al., 2022). CAMP is een activator, een molecuul dat genexpressie stimuleert en dus als
Literatuur
Alberts B., Hopkin K., Johnson A., Morgan D., Raff M., Roberts K. en Walter P. (2019) Essential Cell Biology (5th ed.). W. W. Norton & Company.
Splunter van M. E., Honing van der H. S. en Nitsch L.M. (2022a) Wageningen Universiteit practicum handleiding cursus celbiologie (CBI10306).
Splunter van M. E., Honing van der H. S. en Nitsch L.M. (2022b) Wageningen Universiteit Brightspace cursus celbiologie (CBI10306) brightspace.wur/d2l/le/content/192237/Home : geraadpleegd op 30 September 2022.
Baynes, J. W. (2019). Protein Synthesis and Turnover. sciencedirect.
sciencedirect/topics/medicine-and-dentistry/peptidyltransferase
Verslag lac-operon CBI
Vak: Cell Biology (CBI-10306)
Universiteit: Wageningen University & Research
Dit is een preview
Toegang tot alle documenten
Onbeperkt downloaden
Hogere cijfers halen
