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・偶然、非耐性菌が生えてくる可能性ってどれぐらいなんでしょうか？また、それが非耐性菌であるという証明をすべきではないのでしょうか。
・カナマイシン耐性コロニーがまるごとプラスミドが無くても出来るということは、断片がゲノムに取り込みされているということでしょうか？
それとも、取り込まれなくても子孫に受け継がれるのでしょうか。(ゲノムに取り込まれなくても、受け継がれることもあると見ました。)
・大腸菌に入れた外来DNAがゲノムに取り込みされる確率は1/1000程度と見たことがありますが、それは断片でもプラスミドでも関係ないでしょうか？むしろ断片だと高くなる/遺伝毒性が高くなるなどはありますでしょうか。
また、LNPに入っているとゲノムに取り込まれる可能性は高くなりますか？
・そもそも、カナマイシン耐性遺伝子部分のPCR？をすればよかったのでしょうか
気がついたら一杯になっちゃいました。
お忙しいかと思いますので、お返事は気が向いたらで大丈夫です
あ、あともう一つ
・小さいDNA断片はむしろ遺伝毒性が強い可能性がある、と見たことがあります。そして、配列によって癌原生も異なると。
基準の200bp以下なら問題ないというのは安全性を重視する考えに反してませんか？
(しかもLNPに入っており、SPが膜毒性/核移行シグナルまで持っているという)
回答です。最初の質問、偶然非耐性菌が増えてくることはあるのか。カナマイシン濃度が十分であれば増えてくる可能性は極めて低いです。培養時間を長くしていくと本物の耐性コロニーの周辺に小さいコロニーが出てくることがあります。これはサテライトコロニーと呼ばれるもので、本物のコロニーがカナマイシンを分解してしまいますので、周辺のカナマイシン濃度が低下して出てくるものです。例の図の大腸菌は立派な耐性菌に見えました。
非耐性菌の証明はもう一度別のカナマイシン培地に植えてみればいいのです。この実験はやられていたように思います。別の培地では増えないはず。
プラスミド全長がなくてもコロニーができているというのはカナマイシン遺伝子の断片というか機能的なカナマイシン遺伝子が活性を発揮できる形でゲノムに取り込まれたということです。今回のケースではカナマイシン遺伝子の前にプロモーターがあるので、これも一緒にゲノムに入ったのでしょう。この断片はゲノムに取り込まれないと安定に保持されません、取り込まれないと子孫には受け継がれないでしょう。
プラスミド全長であれば自律的に複製する、つまり勝手に増えるのでゲノムに取り込まれる必要はありません。環状で末端がないので断片よりもゲノムに取り込まれる確率は低いです。断片の方が取り込まれやすくなります。ある意味、遺伝毒性が高いと言えるかもしれません。小断片を大量に細胞に入れれば、ゲノムに取り込まれる個数は増えていき、そのうちのあるものは重要な遺伝子を直撃するでしょう。
私がまずいと思っているのはカナマイシン耐性遺伝子が残っているくらいだからSV 40プロモーターは当然残っていると考えられることです。この配列が発現量依存的に癌を誘導するmyc遺伝子の上流部に入ると発がん確率は上がるでしょうね。
カナマイシン遺伝子のゲノムへの取り込みを調べるには大腸菌ゲノムでの単純なPCRをやればいいことです。これはその通りです。
ツイッターブルーにして良かったと思いました。ブルーでなけなれば何スレッド必要かを考えると雲泥の差です。また遠慮しないで質問して下さいね。
詳しくわかりやすくありがとうございます！
因みに、癌の検体などでSV40プロモーターやスパイクタンパク/その他がゲノムに取り込まれているのか確認出来るのでしょうか？
自分なりに探して、この様な論文を見つけたのですが
nature.com/articles/33022
![プラスミドベクターは、DNA ワクチンや遺伝子治療に広く使用されています。筋肉内注射後、持続するプラスミドは染色体外であり、宿主 DNA への組み込みは、たとえ発生したとしてもごくわずかです。ただし、DNA の配信を改善するための新しい技術は、統合の頻度を増やす可能性があります。本研究では、マウスのエリスロポエチン遺伝子を含むプラスミドを使用して、マウスの筋肉内注射後のプラスミドの取り込みと潜在的な統合に対するエレクトロポレーションの効果をテストしました。エレクトロポレーションにより、プラスミド組織レベルが約 6 ～ 34 倍増加しました。統合のための定量的ゲル精製アッセイを使用して、エレクトロポレーションは、高分子量のゲノム DNA に関連付けられているプラスミドのレベルを著しく増加させることがわかった。統合を確認し、挿入部位を特定するには、生体内で。このアッセイを使用して、4 つの独立した統合イベントを識別しました。挿入部位の配列決定は、ランダムな統合プロセスを示唆しましたが、4 つのケースのうち 3 つのケースで、ベクター ブレークポイントと挿入部位の間に短い相同性セグメントがありました。これは、 in vivo での注射後のゲノム DNA へのプラスミド DNA の統合の最初の決定的なデモンストレーションです。](data:image/svg+xml,<svg xmlns="http://www.w3.org/2000/svg" width="680" height="437"><rect fill-opacity="0"/></svg>)
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「カナマイシン遺伝子の断片というか機能的なカナマイシン遺伝子が活性を発揮できる形でゲノムに取り込まれたということです」が、大腸菌で起きたとして、ヒトで起きる可能性はどの程度なのでしょうか？
また、他の薬で似たような可能性はないのでしょうか？
＞この配列が発現量依存的に癌を誘導するmyc遺伝子の上流部に入ると発がん確率は上がるでしょうね。
これのことかなぁ・・・
引用ツイート
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自粛マスク蛋白マン
@1A48wvlkQc6mVdR
発現ベクターの構造を見ると、AmpRプロモーターがあるります。ならば、このSV40プロモーターは本来不要のはず。専門的な話なのでこの意味は分からなくていいです。ただですね、SV40があるということは、この部分がｍyc（夜魔中がん遺伝子）の上流部に取り込まれた時、がんになる確率が大幅に高まります twitter.com/molbio08/statu…
![画像](data:image/svg+xml,<svg xmlns="http://www.w3.org/2000/svg" width="425" height="333"><rect fill-opacity="0"/></svg>)
一連の情報を見直していますが、問題のプレートのカナマイシン濃度は高くなかったのでは？
とすると、下のコメントから「偶然非耐性菌が増えてくる可能性」はありそうですね。
「偶然非耐性菌が増えてくることはあるのか。カナマイシン濃度が十分であれば増えてくる可能性は極めて低いです。」
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