蛍光タンパク質を選択する

1992 年に GFP（green fluorescent protein）遺伝子がクローニングされて以来¹、さまざまな蛍光タンパク質が登場しました。それらは培養細胞や動物・植物の生体内において、ターゲット・タンパク質との融合タンパク質として発現される他、抗体に標識されたり、酵素反応の基質となったり、さまざまな目的で使用されています。

実験で用いる蛍光タンパク質を選択する際には、使用する目的に応じて留意すべき点がいくつかあります。

蛍光タンパク質の選択に役立つ “Fluorescent proteins reference card” をご用意しました。下のイメージをクリックすると PDF 形式でカードをダウンロードできます。

C 末端融合か N 末端融合か

ターゲット・タンパク質の C 末端側と N 末端側、どちらに蛍光タンパク質を融合させる方がよいかは、そのタンパク質自体の性質によります。例えば、もしどちらかの末端側にタンパク質の機能部位があるのであれば、別の末端側に融合させるべきです。どちらかの末端側がタンパク質の内側に折りたたまれてしまう場合も、別の末端側に融合させるべきです。また、どちらかの末端が翻訳後修飾により切断されてしまうのなら、別の末端側に融合させるべきです。

蛍光タンパク質は N 末端側よりも C 末端側に融合させた方が、その細胞内局在は予想と一致する傾向にある、という報告があります²。ただしあくまでも傾向ですので、ターゲット･タンパク質自体の性質が明らかではない場合は、C 末端側と N 末端側、両方を試してみるべきです。

ターゲット･タンパク質と蛍光タンパク質の融合タンパク質の細胞内局在は、蛍光顕微鏡で直接観察することができます。蛍光タンパク質自体の蛍光強度が低い場合、ウエスタン・ブロットで分子量などを確認する場合、免疫沈降でターゲット･タンパク質を回収したい場合などは、ターゲット・タンパク質に対する抗体、あるいは蛍光タンパク質に対する抗体を使用します。また、ターゲット・タンパク質と相互作用する分子があれば、その分子に対する抗体で共免疫沈降することもできます³。

励起、蛍光、輝度

もし複数の蛍光タンパク質を同時に用いることを検討しているのであれば、それぞれの蛍光波長のピークができるだけ離れているものを選択してください。なおかつ、それら蛍光タンパク質の励起波長が使用する機器のレーザーで対応できるものであるかどうかを確認してください。

明確なシグナルを得、なおかつバックグラウンドの影響を回避するためには、使用機器で利用可能な蛍光タンパク質から最も明るいものを選んでください。蛍光の明るさを示す輝度（蛍光強度）は蛍光物質の吸光係数と量子収率に比例し、それらの実測値から求めることができますので、これらの値を参考にしてください。ただしその数値自体の解釈は簡単ではないため、EGFP といったよく使われる蛍光タンパク質の輝度との相対値で表示される場合も多いようです。

成熟と光安定性

成熟とは、蛍光タンパク質が発現されてから、正しく折りたたまれ、発光団を形成し、蛍光を放出するまでのことです。ライブ・イメージングなどで時間が限られている場合、成熟時間が短いことが重要になってくる場合もあります。例えば、Superfolder GFP (sfGFP)は 10 分間以内にフォールディングされますが、mOrange2 は 4 時間以上かかります。

蛍光物質はタンパク質を含め、光に当たると発光団が光を放出する能力を徐々に失い、蛍光が弱くなっていきます（退色とも言います）。時間の経過に伴う変化を観察するような実験を行なう場合には、光安定性の高い（退色しにくい）蛍光タンパク質を選んでください。光安定性を表す退色半減期（t½；時間当たりの放出光子量が半分になるまでの時間）は蛍光タンパク質によって大きく異なります。例えば T-sapphire は 25 秒ですが、EGFP は 174 秒です⁴。

環境条件

多くのタンパク質同様、蛍光タンパク質も pH、温度、酸素レベルといった溶液の環境に影響を受けます。行う実験の条件に適合する蛍光タンパク質を選択するか、または用いる蛍光タンパク質に合わせて実験条件を調整してください。

励起波長や蛍光波長は pH で変動することがあります。例えば多くの蛍光タンパク質が酸に影響されます。また蛍光強度が pH で変動する蛍光タンパク質もあります（例：pHTomato）。pH 感受性を示す指標としては pKa 値があります。これは溶液中の半分の発光団が蛍光を放出する pH を示します。

成熟時間が温度や酸素レベルに影響される場合があります。至適温度（例：EGFP の場合 37 ℃）を外れている場合、あるいは低酸素状態下では、成熟時間が遅くなる傾向にあります。低酸素にも影響されない、日本ウナギ（Anguilla japonica）から単離された蛍光タンパク質 UnaG のような例もあります⁵。

コドンの最適化

蛍光タンパク質はクラゲやサンゴといった生物由来のものが多く、また広く用いられています。一方発現させる細胞はヒトをはじめとした哺乳動物が多く、クラゲやサンゴとは生物の系統的に大きい隔たりがあります。これが原因で蛍光タンパク質のコドンが発現しにくくなる可能性があります。この問題を解決するため現在では、多くの蛍光タンパク質について、哺乳動物が発現しやすいコドンへと最適化・改変されています。例えば GFP では Jürgen Haas らのグループが、そのコドンを一部改変することにより発現を高め、シグナル強度を 40 ～ 120 倍にまで高めることに成功しています⁶。

もしお手持ちの蛍光タンパク質の発現プラスミドが古いものでしたら、コドンが最適化されていない可能性がありますので、DNA 配列を確認することをお勧めします。

重合体の形成

蛍光タンパク質の中には、ダイマーやオリゴマーといった重合体を形成するものがあります。そしてその形成が蛍光タンパク質自体の機能、あるいは融合タンパク質の機能に影響する場合があります。例えば、通常モノマーで存在する EGFP は高濃度になるとダイマーを形成し、細胞内のオルガネラを変形させてしまう可能性⁷や FRET により実験結果がおかしくなってしまう可能性があります⁸。使用する蛍光タンパク質がモノマーであるかダイマーであるか、そしてそれが用いる実験に影響するかどうか、確認してください。

多くの蛍光タンパク質では、ダイマーやオリゴマーよりもモノマーの状態の方が、高い機能を発揮します。モノマーの蛍光タンパク質は名前の前に「m」が付されていることがあります（例：mCherry）。

蛍光タンパク質についての情報は、GFP and fluorescent proteins のページをご覧ください。

引用文献

1. Prasher, D. C., Eckenrode, V. K., Ward, W. W., Prendergast, F. G. & Cormier, M. J. Primary structure of the Aequorea victoria green-fluorescent protein. Gene 111, 229–233 (1992).

2. Palmer, E. & Freeman, T. Investigation into the use of C- and N-terminal GFP fusion proteins for subcellular localization studies using reverse transfection microarrays. Comp. Funct. Genomics 5, 342–353 (2004).

3. Snapp, E. L. Fluorescent Proteins: A Cell Biologist’s User Guide. Trends Cell Biol. 19, 649–655 (2009).

4. Shaner, N. C., Steinbach, P. A. & Tsien, R. Y. A guide to choosing fluorescent proteins. Nat. Methods 2, 905–909 (2005).

5. Kumagai, A. et al. A bilirubin-inducible fluorescent protein from eel muscle. Cell 153, 1602–1611 (2013).

6. Haas, J., Park, E.-C. & Seed, B. Codon usage limitation in the expression of HIV-1 envelope glycoprotein. Curr. Biol. 6, 315–324 (1996).

7. Snapp, E. L. et al. Formation of stacked ER cisternae by low affinity protein interactions. J. Cell Biol. 163, 257–269 (2003).

8. Zacharias, D. A., Violin, J. D., Newton, A. C. & Tsien, R. Y. Partitioning of lipid-modified monomeric GFPs into membrane microdomains of live cells. Science 296, 913–6 (2002).