（ロザシアニン類の単離）
特開2002-201372の方法に従って、バラ品種「マダムビオレ」の花弁から以下：ロザシアニンA1、ロザシアニンA2、及びロザシアニンBのロザシアニン類を得た。

（ロザデルフィン類を含むバラ科の植物の花弁からの抽出物の作製）
-80℃で冷凍されたバラ品種「アプローズ」の花弁110gを、ビニール袋中で木槌を用いて凍結状態のまま粉砕した。70%エタノール1.5 Lを加え、超音波洗浄機を用いて、20分間ソニック下で抽出した。抽出処理後、12.5cmのブフナー漏斗を用い、No.2ろ紙（Toyo Roshi Kaisha,Ltd）を用いて吸引ろ過し、ろ液をロータリーエバポレーターで約1/5の体積まで減圧濃縮し、エタノールを留去した後、凍結乾燥した。乾燥重量8.33g（生花弁からの収率：7.57%）の粉末を得た。

（ロザデルフィン類を含む分画物及びロザデルフィン類化合物の精製）
＜材料と方法＞
バラ品種「アプローズ」の花弁1100ｇを、エクセルオートホモジナイザーを用いて液体窒素中で凍結粉砕し、0.5%TFAを含む50%アセトニトリルとなるように5.5Lのアセトニトリル、4.4LのミリQ水、55mlのTFAを混合した溶液（花弁の水分を含めて11L）に加え一晩浸漬した。ハイフロスーパーセル（珪藻土）50ｇをプレコートした18cmφのブフナー漏斗で吸引濾過（ｘ3回）した濾液をロータリーエバポレーターで連続濃縮し、約1/2以下の体積まで濃縮した。

この濃縮液を水で平衡化した吸着樹脂HP-20（三菱化学株式会社）2.2Lに負荷した。2.2Lの水洗後、一晩置き、さらに4.4Lの水洗（合計3CV）後、6.6Lの0.1%TFAを含む20%アセトニトリルで溶出し、500mlずつ13画分に分けた。1〜4Fraは溶出物がなかったため、水洗液とともに廃棄した。5〜13Fraは減圧濃縮し、凍結乾燥した。さらに、カラムに残った青色色素類は6.6Lの0.1%TFAを含む60%アセトニトリルで溶出し9Fraに分けて、減圧濃縮、凍結乾燥を行った。7〜9Fraは合併した。60%-4画分前後に青色色素（ロザデルフィンA1）を含む画分が溶出した。

60%-4画分および60%-5画分を、以下の分取HPLCで精製した。カラムはDevelosil-ODS-HG（野村化学社製5cmφｘ 50cm）、移動相はA: 0.5%TFA/水、0.5%TFA/B:50%アセトニトリルを用い、流速:30ml/minで、グラジエント溶出を以下のように行った。B30%(30min保持）、B30→B100%のリニアグラジエント（50min）、B100%を20分間保持した。検出はA260nmで行った。67-82minに溶出した青色色素を含む画分を集め凍結乾燥した。クロマトは60％-4Fra.について6回、60％-5 Fra.について2回繰り返した。

凍結乾燥品を50%アセトニトリルで平衡化したSephadexLH-20カラム（ファルマシア、200mL)に5回に分けて負荷した。50%アセトニトリルで溶出を行い、目視にて青色色素を含む画分を集め、凍結乾燥した。

得られた凍結乾燥品を下記のHPLCで再度分取を行った。
カラムはYMC pack PolymerC18 (ワイエムシー株式会社、2cmφｘ 30cm)、移動相はA: 0.5%TFA/水、B: 0.5%TFA/ アセトニトリル、流速:6ml/min、以下のグラジエント溶出を行った。B32.5%(30min保持）、B32.5→B45%のリニアグラジエント（50min）、B45%を30分間保持し、検出はPDA検出器で250-650nmのデータを収集し、A260nmおよびA560nmのクロマトグラムによりピークを集めた。80-94minに溶出した青色色素（ロザデルフィンA1）を集め凍結乾燥した。クロマトは計5回繰り返した。

成分の分析は下記のHPLC-TOF-MSで行った。
＜HPLC分析条件＞
カラム： SHODEX ODP-40-2D (2 mmφ150 mm x. 昭和電工株式会社)
移動相：A： 1% HCOOH/ H2O、B： 0.1% HCOOH/ CH3CN
溶出条件：B conc. 10%→60% (15min), B conc. 60%iso(5min)→10% (1min), B conc. 10%(15min)
カラム温度；40℃
流速：0.2 ml/min
検出波長：PDA(250-600 nm), A270 nm & A560 nm
注入量：3 μl
＜MS条件＞
MSは、Q-TOF Premier（Micromass社製）でイオン源にＺスプレーイオンソースをつけたESIを用い、ポジティブ、Vモードで測定した。ロックスプレーによる質量補正を行い、リファレンスにはロイシンエンケファリン（m/z 556.2771［M+H］⁺）を用いた。
TOF-detector電圧： 2000 V, Capillary： 2.7KV, Cone： 50V, Source Temp： 150℃、Desolvation Temp： 250℃

理論値として、それぞれ、ロザデルフィンA1は、m/z 1221.1268［Ｍ］⁺、ロザデルフィンBはm/z 435.0352［Ｍ］⁺、ロザデルフィンA2は、m/z 1373.1378［Ｍ］⁺の分子イオンを与え、それぞれの分子式は、Ｃ₅₆Ｈ₃₇Ｏ₃₂、Ｃ₂₂Ｈ₁₁Ｏ₁₀、Ｃ₆₃Ｈ₄₁Ｏ₃₆である。この分子イオンのマスクロマトグラムを元にロザデルフィン類を確認しながら精製した。

＜結果＞
（１）HP-20カラムの分画物
HP-20カラムの分画物は表1のように、まとめて凍結乾燥した。

60%アセトニトリル溶出物は加水分解性タンニン、青色色素類（デルフィニジンとタンニンの結合物）を主成分としており、60%-3〜5FraはロザデルフィンA1およびA2を含有している。

（２）5cmのODS-HPLCによる分画結果
5回にわけて分取HPLCを行い、ロザデルフィンA1を含む画分と前後の色素画分を集めて凍結乾燥した。11.27gを負荷して、2.49gの色素画分を得た（収率：22.1%）。ロザデルフィンA1を含む画分の収率は5.6%であった。

（３）LH-20カラム分画結果
LH-20による分画は、目視により、フラクションを分けた。サンプルは、ODS-HGカラム分画物で上記（2）で得られた凍結乾燥粉末で、5回に分けて負荷した。また50%アセトニトリルの後80%アセトンで溶出しても永久吸着している紫色成分があったので、カラムより樹脂を取り出して1N-HCl（0.2ml）/EtOH（30ml）で色素を溶出し、回収した。この色素はロザデルフィンBが主成分であった。
5回のクロマトを行い、純度20-70%のロザデルフィンA1を含む画分を得た。

（４）2cmのPolymerC18カラムによる分画結果
PolymerC18カラムで精製後のロザデルフィンA1のクロマトグラム（A560nm）を図1に示す。

（５）LC-MS分析結果
ロザデルフィン類は分析時にLC-TOF−MSでロザデルフィン A1、m/z 1221.14のマスクロマトグラムで確認しながら、分画を進めた。
精製の結果、純度90%を超えたロザデルフィンA1は、3.9mg得られた。

（ヒアルロニダーゼ阻害試験）
＜材料と方法＞
実施例２で作製した抽出物（以後、「青バラ花弁抽出物」と記載する）、青バラ花弁抽出物のHP-20カラム分画物（60%アセトニトリル画分）、およびロザデルフィンA1のヒアルロニダーゼ阻害試験は、前田有美恵ら、食品衛生学雑誌31(3),233-237(1990)の方法を改変し、以下の方法にて実施した。ヒアルロン酸はヒアルロニダーゼによりＮ−アセチルへキソサミンに分解される。還元末端のＮ−アセチルグルコサミンを、p-ジメチルアミノベンズアルデヒド（和光純薬工業株式会社製、以下p-DABと略す）標識による発色により吸光度で定量することにより、ヒアルロニダーゼ阻害活性を測定した。

10%DMSOに溶解した試料溶液40 μＬに、0.1M 酢酸緩衝液（pH4．0）に溶解した1000 U/mLヒアルロニダーゼ（Sigma社製）を20 μＬ混合し、37℃で20分間予備加温した。同緩衝液に溶解した0.5 mg/mL Compound 48/80（Sigma社製）を40 μＬ添加し、37℃で20分間静置してヒアルロニダーゼを活性化させた。この溶液に最終濃度0.4 mg/mLとなるよう0.8mg/mLヒアルロン酸カリウム溶液 100 μＬを添加し、37℃で40分間反応させた後、0．4N水酸化ナトリウム溶液を40μＬを添加し、氷冷して反応を停止させた。6Ｎ NaOHでpH9.1に調整した0.8Mホウ酸溶液を40 μＬ反応液に加え、100℃で3分間煮沸した。氷中で室温まで冷却し、これに、遮光した10 mg/mL p-ジメチルアミノベンズアルデヒド（p-DAB）溶液を1.2 mL添加し、37℃で20分間反応させた後、585nmの吸光度（A₅₈₅）を測定した。試料のヒアルロニダーゼ阻害活性は次式から求められる阻害率で表した。
阻害率（％）={1−（ａ−ｂ）/（ｃ−ｄ）}×100
ａ：酵素を添加した試料溶液のA₅₈₅
ｂ：酵素を添加していない試料溶液のA₅₈₅
ｃ：酵素を添加した対照溶液のA₅₈₅
ｄ：酵素を添加していない対照溶液のA₅₈₅

また、陽性対照には、試料溶液の代わりに800 μg/ml（モル濃度1．56 mM）のクロモグリク酸ナトリウム（Sigma社製、以下DSCGと略す）を40 μＬ添加して、試験濃度160μg/mlのDSCGを用いた。

＜結果＞
（１）60%アセトニトリル画分のヒアルロニダーゼ阻害試験
青バラ花弁抽出物をHP-20カラム分画して得られた60%アセトニトリル画分について、試験濃度10、20 μg/mlにおけるヒアルロニダーゼ阻害率（%）を測定したところ、表2に示す通りとなった。3-5 Fra.は青バラ特有の色素成分ロザデルフィン A1を含み、そのうち4Fra.と5Fraの含有率が多いことを、TOF-MS分析により確認している。

3-6 Fra.は、青バラ花弁抽出物の2分の1の試験濃度において、青バラ花弁抽出物より強いヒアルロニダーゼ阻害活性を示し、ロザデルフィン A1の含有率が最も高い4 Fra.が、最も強い活性を示した。この結果より、3-5 Fra.は活性成分を含むこと、ロザデルフィンA1が、青バラ花弁抽出物中のヒアルロニダーゼ阻害活性を示す活性成分である可能性が示唆された。

（３）ロザデルフィン A1および類縁化合物のヒアルロニダーゼ阻害試験
青バラ花弁抽出物より精製した青色色素成分ロザデルフィン A1について、試験濃度20、40、80 μg/mlにおけるヒアルロニダーゼ阻害率（%）を測定したところ、表3に示す通りとなった。ロザデルフィンA1が、青バラ花弁抽出物中の活性成分であることが明らかになった。濃度依存的に強い活性を示すことから、ロザデルフィン A1の用量反応性も確認している。

また、ロザデルフィン A1の構造の構成成分である、テリマグランジン 1、宿主株の青色色素成分であるロザシアニンA1の活性を同時に測定し、活性の強さの比較を行った。ロザシアニン A1は、ロザデルフィン A1と同等の活性を示した。アプローズにも含まれており、バラ科の植物にも存在する加水分解性タンニン、テリマグランジン 1は、ロザデルフィンA1よりも低いが活性を示した。

市販されているバラ花弁抽出素材のひとつに、東洋発酵社製のROSE CRYSTA-70（商標）がある。この素材は、加水分解性タンニンの１種であるオイゲニインが含まれており、総フェノール量70%が規格されている素材である。青バラ花弁抽出物は、ROSE CRYSTA-70（商標）よりも、強いヒアルロニダーゼ阻害活性を示したことからも（表4）、ロザデルフィン A1を含む青色色素群は、加水分解性タンニン類よりも活性が強いことを裏付けるデータが得られた。

各化合物のヒアルロニダーゼ阻害活性は、ロザシアニンA1、ロザデルフィンA1＞青バラ花弁抽出物＞テリマグランジン 1の順に強いことが分かった。また、ロザデルフィンA1がテリマグランジン1と比較して、より強い活性を持つことが明らかとなり、従来用いられてきたバラ抽出素材に勝る保湿作用効果を有すると考えられる。

以上のように、青バラ花弁抽出物、中でも青色色素ロザデルフィン類を含む画分、ロザデルフィン A1、および非組換え体の青色色素ロザシアニン A1は強いヒアルロニダーゼ阻害活性を持つことが明らかになった。

（コラゲナーゼ阻害試験）
＜材料と方法＞
青バラ花弁抽出物、青バラ花弁抽出物のカラム処理物（60%アセトニトリル画分）、ロザデルフィンA1、ロザシアニンA1及びテリマグランジン1のコラゲナーゼ阻害試験は、文献（Wunschら、Hoppe Seylers Z Physiol Chem., 333,149-51（1963））の方法を改変し、以下の方法にて実施した。

酵素溶液は、100 μg/mL（55.1 unit/mL）の濃度になるよう、コラゲナーゼTypeIV（Sigma社製）10 mgを蒸留水1 mLに溶解し、使用時に50倍に希釈して使用した。基質溶液には、PZ-ペプチド（4-phenylazo-benzyloxycarbonyl-Pro-Leu-Gly-Pro-D- Arg-OH）（Pz-Pro-Leu-Gly-Pro-D- Arg-OH、Sigma社製）の濃度が0.5 μg/mLになるように20 nmol/Lの塩化カルシウムを含有するトリス塩酸緩衝液（pH７.１）に溶解して使用した。10%ＤＭＳＯに溶解した試料溶液20 μLに、酵素溶液20 μL及び基質溶液160 μLを混合し、37℃で３０分間反応させた。次いで25 mMクエン酸溶液400 μLを加えて反応を停止させ、反応液中のPz-Pro-Leuを酢酸エチル2 mLで抽出した。得られた酢酸エチル層の波長320 nmにおける吸光度を、酢酸エチルを対照として測定した。また、各試料の阻害活性は、次の式で求められる阻害率で算出した。
コラゲナーゼ阻害率（%）= { １ −（ a−b ）/（ c −d ）} ×１００
ａ：試料添加時 反応３０分後の吸光度
ｂ：試料添加時 反応０分後の吸光度
ｃ：試料無添加 反応３０分後の吸光度
ｄ：試料無添加 反応０分後の吸光度

上記式において、コラゲナーゼの活性が完全に阻害された場合には、コラゲナーゼ阻害率（%）は100%となる。高い「阻害率（%）」を示す化合物が、阻害剤としての活性がより高いと言える。

コラゲナーゼ阻害試験においては、陽性対照には試料溶液の代りに、800 μg/mL（モル濃度0.176 mM）のIsoamylphosphonyl-Glycyl-L-Proly-L-Alaine, dipotassium salt；C₁₅H₂₆K₂N₃O₆P（Elastin Products Company, Inc.製、以下IP304と略す）を20 μL添加（反応時の濃度は80 μg/mL）して用いた。

＜結果＞
（１）60%アセトニトリル画分のコラゲナーゼ阻害試験
青バラ花弁抽出物をHP-20カラム分画して得られた60%アセトニトリル画分について、試験濃度40、80 μg/mlにおけるコラゲナーゼ阻害率（%）を測定したところ、表5に示す通りとなった。3-5 Fra.は、フラボノイド3', 5'-水酸化酵素遺伝子を有するバラ特有の色素成分ロザデルフィンA1を含み、そのうち4 Fra.と5Fraの含有率が多いことを、TOF-MS分析により確認している。

3-5 Fra.は、青バラ花弁抽出物の2分の1の試験濃度において、また、1, 2, 6 Fra.は、青バラ花弁抽出物と同じ試験濃度において、青バラ花弁抽出物より強いコラゲナーゼ阻害活性を示した。この結果より、3-5 Fra.は活性成分を含むこと、ロザデルフィンA1が、青バラ花弁抽出物中のコラゲナーゼ阻害活性を示す活性成分であることが示唆された。また、ロザデルフィンA1を含む3-5 fra.に限らず、60%アセトニトリル画分のすべてのFra.が、比較的高い活性を有したことから、青色色素化合物群全般が、活性を有することが明らかになった。

（２）ロザデルフィンA1およびその類縁体のコラゲナーゼ阻害試験
青バラ花弁抽出物より精製した青色色素成分、ロザデルフィンA1について、試験濃度40μg/mlにおけるコラゲナーゼ阻害率（%）を測定したところ、表6に示す通りとなった。ロザデルフィンA1が、青バラ花弁抽出物中の活性成分であることが明らかになった。

また、ロザデルフィンA1の構造の構成成分である、テリマグランジン1、宿主株の青色色素成分であるロザシアニンA1の活性を同時に測定し、活性の強さの比較を行った。

各化合物の40 μg/mLにおけるコラゲナーゼ阻害活性については、ロザシアニンA1、テリマグランジン1、ロザデルフィンA1はいずれも青バラ花弁抽出物を上回る活性であった。

（エラスターゼ阻害試験）
＜材料と方法＞
青バラ花弁抽出物、青バラ花弁抽出物のカラム処理物（60%アセトニトリル画分）、ロザデルフィンA1、ロザシアニンA1およびテリマグランジン1のエラスターゼ阻害試験は、以下の方法にて実施した。

酵素溶液は、0.05 unit/mLの濃度になるよう、エラスターゼ（Sigma社製）0.1 mlをpH8.0の0.2 Mトリス緩衝液（以下、トリス緩衝液と記載）を用いて、使用時に100倍希釈して使用した。基質溶液は、N-Succinyl-Ala-Ala-Ala-p- nitroanilide（Sigma社製）の濃度が4mMとなるようにトリス緩衝液に溶解して使用した。96ウェルプレートに、10%DMSOに溶解させた各試料溶液50 μL、および酵素溶液50 μLを添加して、プレートシェーカーで混合し、25℃で10分間予備加温した。次いで基質溶液100 μLを加えてプレートシェーカーで混合し、25℃で30分間反応させた後に速やかに、p-nitroaniline の遊離を波長405 nmの吸光度（以下、A405）で測定した。ブランクのA405は、基質溶液の代わりにトリス緩衝液を添加して測定し、対照溶液のA405は、試料溶液の代わりに10%DMSOを添加して測定した。また、各試料の阻害活性は、次の式で求められる阻害率で算出した。
エラスターゼ阻害率（%）=[（f−e）−｛（b−a）−（d−c）｝] /（f−e）×100
a：試料溶液の基質反応用のA₄₀₅（0min）
b：試料溶液の基質反応用のA₄₀₅（30min）
c：試料溶液のブランクのA₄₀₅（0min）
d：試料溶液のブランクのA₄₀₅（30min）
e：対照溶液のA₄₀₅（0min）
f：対照溶液のA₄₀₅（30min）

上記式において、エラスターゼの活性が完全に阻害された場合には、エラスターゼ阻害率（%）は、100%となる。高い「阻害率（%）」を示す化合物が、阻害剤としての活性が高いと言える。

エラスターゼ阻害試験においては、陽性対照には試料溶液の代わりに、320 μg/mL（モル濃度 1.84 mM）のPhenylmethanesulfonyl fluoride；C₇H₇FO₂S（Sigma社製、以下PMSFと略す）を50 μL添加（反応時の濃度は80 μg/mL）して用いた。

＜結果＞
（１） 60%アセトニトリル画分のエラスターゼ阻害試験
青バラ花弁抽出物をHP-20カラム分画して得られた60%アセトニトリル画分について、試験濃度40、80、160 μg/mlにおけるエラスターゼ阻害率（%）を測定したところ、表7に示す通りとなった。3-5 Fra.は青バラ特有の色素成分ロザデルフィンA1を含み、そのうち4 Fra.と5Fraの含有率が多いことを、TOF-MS分析により確認している。
60%アセトニトリル画分4-9Fra.は、HP-20カラム分画前の青バラ花弁抽出物よりも強い活性を示した。特に60%アセトニトリル画分6-9Fra.が強い活性を有したことから、ロザデルフィン類だけでなく青色色素化合物群全般が、強い活性を有することが明らかになった。

（２） ロザデルフィン A1のエラスターゼ阻害試験
青バラ花弁抽出物より精製した青色色素成分ロザデルフィン A1について、試験濃度40、80、160 μg/mlにおけるエラスターゼ阻害率（%）を測定したところ、表8に示す通りとなった。ロザデルフィンA1が、濃度依存的に強い活性を示すことから、ロザデルフィン A1の用量反応性も確認している。

また、ロザデルフィン A1の構造の構成成分である、テリマグランジン 1、宿主株の青色色素成分であるロザシアニンA1の活性を同時に測定し、活性の強さの比較を行った。ロザデルフィン A1は、ロザシアニンA1と同等以上の活性を示した。バラ科の植物に含まれる加水分解性タンニンの1種であるテリマグランジン1は、弱い活性を示すのに対し、ロザデルフィン A1およびロザシアニン A1が強い活性を示したことから、青色色素化合物群が含まれることにより、青系のバラ花弁由来抽出物は、市販のバラエキスよりも、強い活性を有すると考えられる。

（コラーゲン合成促進試験）
＜材料と方法＞
正常ヒト線維芽細胞を、0.5%仔牛血清含有ダルベッコ変法MEM（0.5%FBS-DMEM）を用いて2.0×10⁴cell/wellの細胞密度にて96穴プレートに播種した。播種24時間後に、0.5%FBS-DMEMを、細胞障害性のない青バラ花弁抽出物濃度を最高濃度として、これを希釈した、青バラ花弁抽出物を含有する0.5%FBS-DMEMと交換した。なお陽性コントロールとして25μMアスコルビン酸リン酸マグネシウム塩（VC-PMg）を用いた。青バラ花弁抽出物のカラム処理物含有培地で24時間培養したのち、培養上清を回収してELISAに供した。細胞は0.5％TritonX-100溶液にて溶解したのち、BCA法にてタンパク量を定量した。

培地および検量線用のＩ型コラーゲン溶液を高吸着型ELISAプレートに入れ、4℃にて一昼夜コーティングしたのち、1%牛血清アルブミン（BSA）溶液を用いて37℃にて1時間ブロッキングした。一次抗体反応は、Anti-Human Collagen TypeＩantibody(Rabbit)を0.3%BSA溶液で希釈したものを添加し、37℃にて1.5時間反応させた。二次抗体反応は、ヒストファインMAX-PO（R）（Rabbit）をリン酸緩衝液で希釈したものを添加し、37℃にて1.5時間反応させた。

次に、0.3mg/mLの2,2’-Azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) diammonium salt(ABTS)および0.03%の過酸化水素を含むリン酸-クエン酸緩衝液（0.1M,pH4.0）を添加して30分間反応させ、マイクロプレートリーダーにて405nmの吸光度を測定した。

培地中のＩ型コラーゲン量は、同じELISAプレートで測定した検量線から算出した。全細胞のタンパク量で培地中のＩ型コラーゲン量を除することによって単位タンパク量あたりのＩ型コラーゲン合成量を算出した。それぞれのＩ型コラーゲン合成量はStudent t検定を用いて有意差検定を行い、コントロールと比較した。

＜結果＞
青バラ花弁抽出物のＩ型コラーゲン合成量を図２に示した。試験試料の添加により、Ｉ型コラーゲン合成量の有意な増加が認められた。

（ＭＭＰ−１産生抑制試験）
ＭＭＰ−１（マトリックスメタロプロテアーゼ−１）（英:Matrix metalloproteinase、MMP）は、間質コラゲナーゼともよばれ、コラーゲンの分解に関わるメタプロテアーゼ(活性中心に金属イオンが配座しているタンパク質分解酵素)の一つである。ＭＭＰ−１の産生を阻害することで、コラーゲンの分解が抑制される。

ＭＭＰ−１産生の抑制における青バラ花弁抽出物の効果について検討した。新生児由来正常ヒト皮膚線維芽細胞（ＮＨＤＦ−ＮＢ、クラボウ株式会社より購入）を真皮線維芽細胞として用いて、ＭＭＰ−１の産生量を指標として検討を行った。

２４ウェルプレートに真皮線維芽細胞を播種し、３７℃、二酸化炭素濃度５ｖｏｌ％中にてコンフルエントになるまで培養した。その後、ＤＭＳＯに溶解した青バラ花弁抽出物を０、５、１０、２０ｍｇ／ｍＬの濃度で添加した。ＤＭＳＯは最終濃度が０．１％となるように添加した。２４時間培養した後、ＩＬ−１βを最終濃度１００ｐｇ／ｍＬで培地に添加した。ＤＭＳＯ溶液のみを添加したウェルの一部にはＩＬ−１βを添加しないものとし、これをコントロールとした。４８時間培養後、培養上清を回収し、培地中に分泌されたｐｒｏＭＭＰ−１を定量し、ＭＭＰ−１の産生量とした。ｐｒｏＭＭＰ−１の定量は、定量ＥＬＩＳＡ Ｋｉｔ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用い、添付された説明書に従って行った。定量結果は、コントロールについてのＭＭＰ−１の産生量を１００％とする相対値（％）として示した（表９）。

真皮線維芽細胞にＩＬ−１βのみを添加すると、ＭＭＰ−１の産生量は、コントロールのおよそ４倍となった。そして、青バラ花弁抽出物で細胞を処理した場合、いずれの濃度においてもＩＬ−１βによるＭＭＰ−１の産生が顕著に抑制された。

これらの結果から、青バラ花弁抽出物は、優れたＭＭＰ−１産生抑制効果を有することが示された。