UNIVERSIDADE FEDERAL DE SÃO CARLOS CENTRO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS E DA SAÚDE PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM GENÉTICA EVOLUTIVA E BIOLOGIA MOLECULAR

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1 UNIVERSIDADE FEDERAL DE SÃO CARLOS CENTRO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS E DA SAÚDE PROGRAMA DE PÓSGRADUAÇÃO EM GENÉTICA EVOLUTIVA E BIOLOGIA MOLECULAR CAROLINA DE BARROS MACHADO DA SILVA FILOGENIA MOLECULAR E FILOGEOGRAFIA DO GÊNERO Salminus (CHARACIFORMES) SÃO CARLOS 2016

2 UNIVERSIDADE FEDERAL DE SÃO CARLOS CENTRO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS E DA SAÚDE PROGRAMA DE PÓSGRADUAÇÃO EM GENÉTICA EVOLUTIVA E BIOLOGIA MOLECULAR CAROLINA DE BARROS MACHADO DA SILVA FILOGENIA MOLECULAR E FILOGEOGRAFIA DO GÊNERO Salminus (CHARACIFORMES) Tese de Doutorado apresentada ao Programa de PósGraduação em Genética Evolutiva e Biologia Molecular da Universidade Federal de São Carlos como parte dos prérequisitos para a obtenção do título de Doutor em Ciências, Área de Concentração: Genética e Evolução Orientador: Prof. Dr. Pedro Manoel Galetti Jr. SÃO CARLOS 2016

3 Ficha catalográfica elaborada pelo DePT da Biblioteca Comunitária UFSCar Processamento Técnico com os dados fornecidos pelo(a) autor(a) S586f Silva, Carolina de Barros Machado da Filogenia molecular e filogeografia do gênero Salminus (Characiformes) / Carolina de Barros Machado da Silva. São Carlos : UFSCar, p. Tese (Doutorado) Universidade Federal de São Carlos, Abordagem ABC. 2. América do Sul. 3. Biogeografia. 4. DNA barcoding. 5. GMYC. I. Título.

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5 Dedico à minha família, Paulo (Painho), Rosana (Mainha), Paula e Mariana, por estarem sempre ao meu lado nessa jornada! E a David, pelo apoio incondicional. Agradeço a eles todo amor e carinho recebido.

6 AGRADECIMENTOS A Deus pelo dom da vida, renovado após cada provação que se apresenta e nos sonhos que se concretizaram, pela oportunidade de aprender e conviver com pessoas tão especiais e, principalmente, por iluminar meus caminhos mais escuros. Aos meus pais, Paulo e Rosana, e minhas irmãs, Paula e Mariana, que, com muito amor, carinho, compreensão e apoio, não mediram esforços para que eu chegasse até esta etapa da minha vida. Ao meu namorado David, por estar comigo desde o primeiro dia em que essa etapa se iniciou e pelo incentivo incondicional para que grandes momentos desse Doutorado fossem concretizados. Obrigada pelo amor, suporte, amizade e pelo Logan. À Universidade Federal de São Carlos, através do Programa de PósGraduação em Genética Evolutiva e Biologia Molecular (PPGGEv), pela oportunidade concedida e formação acadêmica. Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) e à Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP), ambos pelo suporte financeiro para o desenvolvimento da pesquisa. À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES), pela concessão da bolsa de estudos e pelo financiamento para o aperfeiçoamento profissional no exterior. Ao professor Pedro Manoel Galetti Junior por ter aceitado encontrar com uma desconhecida (eu!) em João Pessoa e, sem saber nada sobre mim, ter tido a coragem de apostar que eu vestiria a camisa do LabBMC. Obrigada por ter dito que iríamos fazer um lindo trabalho quando passei na seleção. Essa confiança fez uma grande diferença! Agradeço muito pela orientação, incentivo e pela autonomia para desenvolver esse projeto. Tenha certeza que o meu crescimento profissional nesse ambiente foi estrondoso. À professora Ana Carolina Carnaval, pelo acolhimento e atenção durante todo meu período de intercâmbio na City College of New York, NYC, NY, EUA. Muito obrigada pelas valiosas contribuições intelectuais e canetadas, muitas vezes assustadoras, em minhas produções científicas. Com certeza esses ensinamentos jamais serão esquecidos. I m grateful to all The Carnaval Lab members for the wonderful company. Thanks for the help on data analyses, the discussions about my project, and the happy hours at the Grill on the Hill. Thank you for being so dedicated to make me happy. Ivan, Peter, Maria, Dani and Esmeralda, thank you guys for the friendship. Aos meus amigos de faculdade Brunão, Bruninho, Dani, Laura e Mi que apesar da falta de tempo ou da grande distância física entre nós, sempre se fizeram presentes pelo

7 whatsapp ou pela thread eterna. A vocês agradeço por tudo que vivi e me tornei nos últimos anos. À equipe, Hugo, Janaína, Kellen e Ruthanna, por serem grandes amigos e não permitirem que eu me desconecte de Recife. Obrigada pelos carnavais, pelo Mercado e pelos sushis. Agradeço até por entenderem quando o ônibus São CarlosConde da Boa Vista atrasa e eu perco os compromissos. Principalmente, agradeço a Ruthanna por mais de 17 anos de amizade. Amiga...obrigada por me ensinar o significado de uma amizade leve e tranquila. Ao Laboratório de Genética Legal, mesmo sem termos contato, agradeço a todos pelo apoio para que eu pudesse realizar voos mais altos! O carinho e as boas lembranças que tive com vocês durante a graduação e o mestrado permanecerão sempre vivos. Ao Laboratório de Biodiversidade Molecular e Conservação, sem nomeações, afinal ao longo de 4 anos muitas pessoas passaram por aqui e com certeza esquecerei alguém. Agradeço a todos vocês por me fazer crescer profissionalmente, pela ajuda na hora de pensar em como discutir esse trabalho, pelos almoços e confraternizações. Um agradecimento especial a Jorge, por trazer amostras para mim lá de onde o vento faz a curva e pelas discussões fantásticas para construção desse trabalho e do meu pensamento crítico. A Ueslei, pelo apoio, amizade, companhia até tarde no laboratório, e pela grande ajuda de bancada enquanto estava fora do país. Aos demais, obrigada pela presença nesta fase da minha vida. Muito obrigada a todos!

8 We cannot solve our problems with the same thinking we used when we created them Albert Einstein

9 RESUMO Salminus é um gênero constituído por quatro espécies de peixes Neotropicais de médio e grande porte, predadores topo de cadeia, que possuem importância na pesca comercial e esportiva. Escassez de informações quanto a taxonomia, filogenia e filogeografia, dificultam medidas de conservações adequadas para o gênero, que se encontra em acentuado declínio populacional. Por essa razão, este estudo objetivou, através do emprego de marcadores moleculares mitocondriais (COI, Cytb e Dloop) e nucleares (RAG2 e íntron do S7), elucidar incertezas taxonômicas, identificar diversidade críptica, investigar as relações filogenéticas entre as espécies e inferir os processos históricos que modelaram a distribuição atual do gênero Salminus. Para auxiliar nas questões taxonômicas, nós empregamos análise de DNA barcoding tradicional e GMYC utilizando o marcador COI em 110 espécimes, representando as quatros espécies válidas. Em ambas metodologias, oito MOTUs (unidades taxonômicas operacionais moleculares) foram identificadas. Apenas duas espécies, Salminus affinis e Salminus franciscanus, apresentaram uma única MOTU cada. As espécies Salminus brasiliensis e Salminus hilarii foram representadas por duas e quatro MOTUs, respectivamente. Essas MOTUs estão distribuídas em distintas bacias hidrográficas onde polimorfismos morfológicos já haviam sido descritos. As médias das distâncias intraespecíficas superiores ao threshold ótimo de 1.1% (S. brasiliensis 3.6%, e S. hilarii 5%), reforçam a ideia de mais unidades taxonômicas em Salminus. A análise multiloci recuperou informações interessantes quanto à diversidade críptica: as linhagens mitocondriais parafiléticas de S. brasiliensis, uma proveniente do Alto rio Paraná e outra formada por espécimes das demais regiões da bacia Platina, formaram um único grupo monofilético. Para S. hilarii, apesar de quatros MOTUs observadas, apenas três foram recuperadas. Portanto, baseada na análise multiloci e no conceito filogenético de espécie, propomos um novo cenário taxonômico para Salminus. O gênero passa a ser constituído por seis espécies: S. affinis, S. franciscanus, S. brasiliensis, S. hilarii, Salminus sp. Amazonas e Salminus sp. Araguaia. A filogenia recriada refutou hipóteses previamente propostas. S. affinis, única espécie transandina, foi a espécieirmã dos demais Salminus, que formam dois grandes grupos: grupo Noroeste, constituído por S. sp. Amazonas e S. sp. Araguaia, e grupo Sudeste, composto por S. brasiliensis, S. franciscanus e S. hilarii. Os processos de divergência entre as espécies do gênero se iniciou no Mioceno Superior e está associada a eventos de vicariância e geodispersão que modelaram a paisagem hidrogeológica nos últimos 12 milhões de anos. Pela primeira vez, foi utilizado uma abordagem baseada em modelos para testar cenários

10 biogeográficos alternativos e distinguir se existem assinaturas filogeográficas entre os eventos responsáveis pelo processo de diversificação de peixes Neotropicais. Nós evidenciamos que distintas assinaturas filogeográficas entre vicariância e geodispersão puderam ser detectadas em nosso modelo biológico. A clara designação das espécies por si só já acarreta em uma informação valiosa para conservação, afinal seis unidades biológicas precisam ser protegidas. Como essas espécies estão localizadas em distintas bacias hidrográficas, cada bacia passa ser avaliada como uma unidade biogeográfica importante para a manutenção dos processos evolutivos e ecológicos que sustentam a diversidade e permanência das espécies. Palavras chaves: Abordagem ABC; América do Sul, Biogeografia; DNA barcoding; GMYC; Unidades Evolutivas Significativas.

11 ABSTRACT Salminus is a genus comprised of four Neotropical medium and largesized fishes species, top predators, with both recreational and commercial importance. The paucity of information on taxonomy, phylogeny and phylogeography make appropriate conservation policies difficult for the genus, which is in a significant population decline. For this reason, our goal was, by using mitochondrial (COI, Cytb and Dloop) and nuclear (RAG2 and S7 intron) molecular makers, to elucidate taxonomic uncertainties, identify cryptic diversity, investigate the phylogenetic relationship among the species and infer the historical processes that shaped the current Salminus distribution. To assist in taxonomic issues, we employed the traditional DNA barcoding and GMYC COIbased analyses in 110 specimens, representing the four valid species. In both methodologies, eight MOTUs (molecular operational taxonomic units) were identified. Only two species, Salminus affinis and Salminus franciscanus, represented a MOTU each. The species Salminus brasiliensis and Salminus hilarii were represented by two and four MOTU, respectively. These MOTUs are distributed in distinct hydrographic basins where morphological polymorphisms had already been described. The average intraspecific distances greater than the optimal threshold of 1.1% (S. brasiliensis 3.6%, e S. hilarii 5%), reinforce the idea of more taxonomic units in Salminus. The multiloci analysis recovered interesting information about the cryptic diversity: the paraphyletic mitochondrial lineages of S. brasiliensis, one from Upper Paraná river and another composed of specimens from the other regions of the Platina basin, formed a unique monophyletic group. For S. hilarii, despite the four MOTUs observed, only three of them were recovered. Therefore, based on multiloci analysis and phylogenetic species concept, we proposed a new taxonomic scenario for Salminus. The genus is now composed of six species: S. affinis, S. franciscanus, S. brasiliensis, S. hilarii, Salminus sp. Amazonas and Salminus sp. Araguaia. The phylogeny reconstruction refuted hypotheses previously proposed. S. affinis, the only transandean species, was the sister species of the other Salminus, which formed two main groups: Northwest group, composed of S. sp. Amazonas and S. sp. Araguaia, and Southeast group, formed by S. brasiliensis, S. franciscanus and S. hilarii. The divergence processes among Salminus began in Later Miocene and it is associated with vicariance and geodispersion events that shaped the hydrological landscape in the past 12 million years. For the first time, it was used a modelbased approach in order to test alternative biogeographic scenarios and to distinguish phylogeography signatures among the events responsible for Neotropical fishes diversification. We evidenced that the distinct vicariance and geodispersion signatures could

12 be detected in our biological model. A clear description of these species brings in a valuable information for conservation, because, now, six biological units need to be protected. As these species are located in distinct hydrographic basins, each basin becomes one important biogeographic unit to maintain the evolutionary and ecological processes that sustain the species permanence and diversity. Key words: ABC approach; Biogeography; DNA barcoding; Evolutionary Significant Units; GMYC; South America.

13 LISTA DE FIGURAS Página Fundamentação Teórica Figura 1 Características geológicas e topográficas da Placa sulamericana. As letras representam alguns dos principais arcos estruturais da América do Sul: (a) Arco de Gurupa, (b) Arco de Purus, (c) Arco de Vaupes e (d) Arco de Michicola. As setas vermelhas indicam o sentido de deslocamento das placas tectônicas (Modificado de LUNDBERG et al., 1998). 23 Figura 2 Estimativas no nível do mar derivadas a partir de Nova Jérsei (EUA) que providenciam um registro global para os últimos 100 Ma e como interferiram na paisagem hidrológica sulamericana entre Ma. As diferentes cores representam as fontes bibliográficas de onde os dados foram retirados: laranja Kominz et al. (2008) azul Miller et al. (2005) e roxo Lisiecki e Raymo (2004). Modificado a partir de Miller et al. (2011). 25 Figura 3 Distribuição geográfica das espécies de Salminus. (A) Salminus affinis. (B) Salminus brasiliensis. (C) Salminus hilarii. (D) Salminus franciscanus. As cores representam as diferentes bacias hidrográficas sulamericanas. 32 Figura 4 Relações intragenéricas entre as espécies de Salminus, (A) baseadas em dados moleculares (ABE et al., 2014) e (B) dados morfológicos (LIMA, 2006). 34 Capítulo 1 Figura 1 Bacias hidrográficas onde ocorrem as espécies de Salminus e os locais 83

14 de coleta (símbolos amarelos): (1.1) Salminus affinis, círculos; (1.2) Salminus brasiliensis, quadrados; (1.3) Salminus hilarii, triângulos; e (1.4) Salminus franciscanus, estrelas. Figura 2 Topologias derivadas de duas abordagens de delimitações de espécies baseadas em 136 sequências COI de Salminus. (2.1) DNA barcoding tradicional: topologia de NJ com valores de bootstrap localizados acima dos ramos. (2.2) Topologia de IB com probabilidades posteriores. A barra vertical cinza indica o único ponto de transição entre os processos de especiação/extinção e coalescência, com máximo valor de verossimilhança. Apenas probabilidade maiores que 80% foram representadas. Ambas topologias foram construídas com sequências do banco de dados da BOLD (espécimes FUPR, BSB e FARGB) e as sequências produzidas neste trabalho; Símbolos representam as quatro espécies nominais: S. affinis (círculo), S. brasiliensis (quadrado), S. franciscanus (estrela) e S. hilarii (triângulo). 84 Figura 3 Comparação entre a distância COI intra e interespecífica utilizando as quatros espécies de Salminus atualmente válidas. Os quatro quadrantes indicados representam: (I) concordância entre a taxonomia atual e identificação molecular; (II) possível existência de espécies crípticas; (III) recente divergência, sinonímia ou hibridização; e, (VI) nenhuma correspondência entre taxonomia e identificação molecular. 85 Figura 4 Topologia de IB do marcador RAG2 com 24 sequências (926 pb). Símbolos representam as quatro espécies nominais: S. affinis (círculo), S. brasiliensis (quadrado), S. franciscanus (estrela) e S. hilarii (triângulo). Número acima dos ramos representam probabilidades posteriores. Apenas probabilidades acima de 90% são representadas. 86

15 Capítulo 2 Figura 1 Reconstrução dos cenários evolutivos para testar as hipóteses Paleogeográfica e Hidrogeológica. (1) Hipótese Paleogeográfica apresenta uma assinatura de vicariância. Neste cenário, nós assumimos uma população ancestral, com tamanho efetivo Na, que no tempo t3 sofre uma divisão e duas novas populações são formadas com tamanho efetivo menor que o Na (N1 e N2). (2) Hipótese Hidrogeológica tem uma assinatura de geodispersão. Nós assumimos um pequeno número de fundadores (N1f ou N2f, onde f significa fundador), originado a partir de uma baciafonte, que coloniza uma bacia adjacente após o evento de captura em t3, seguida por uma expansão populacional em t Figura 2 Locais de coleta de Salminus. Salminus affinis ( ), Salminus brasiliensis ( ), Salminus franciscanus ( ), Salminus hilarii ( ), Salminus sp. Amazonas ( ) e Salminus sp. Araguaia ( ). 138 Figura 3 Cenários evolutivos testados através da análise ABC no DIYABC. Em (a) S. brasiliensis, (b) S. sp. Araguaia e S. sp. Amazonas e (c) S. hilarii. Cores representam as bacias hidrográficas onde as amostras foram coletadas (Fig. 2). 139 Figura 4 Análise filogenética bayesiana e estimativa de tempo de divergência no BEAST v1.8.1 empregando dois marcadores mitocondriais (COI e CytB) e dois nucleares (RAG2 e S7). Nós usamos um evento biogeográfico para a calibração da topologia (círculo vermelho). Números abaixo dos nós representam as estimativas de tempo de divergência, enquanto os números acima representam a probabilidade posterior. Barras azuis representam 95% HPD dos tempos estimados. 140 Figura S1 Primeira rodada dos cenários evolutivos testados para S. hilarii usando o DIYABC. (a) cenário de vicariância, (b) cenário de 141

16 geodispersão com o Alto rio Paraná como baciafonte, e (c) cenário de geodispersão com o rio São Francisco como baciafonte. Figura S2 Filogenias gênicas recuperadas através da análise bayesiana, realizadas no BEAST, para o gênero Salminus. (a) COI; (b) Cytb; (c) RAG2 e (d) íntron S7. A barra de escala representa a estimativa de substituição por sítio. Números acima dos nós indicam as probabilidades posteriores aceitáveis (>0.90). O grupo externo foi retirado da ilustração. 142 Figura S3 Estimativa de áreas ancestrais para as espécies de Salminus de acordo com o modelo biogeográfico mais provável (DIVALIKEj) calculado a partir do BioGeoBEARS. As setas indicam prováveis eventos de geodispersão, hipotetizados a partir da correlação com dados geológicos conhecidos. 143 Apêndice Apêndice 1 Fotografia das MOTUs de Salminus estimadas na análise multiloci. (A) Salminus affinis (indivíduo não analisado). (B) Salminus brasiliensis (indivíduo SB_580). (C) Salminus franciscanus (indivíduo SF_035). (D) Salminus hilarii (indivíduo SH_160). (E) Salminus sp. Amazonas (indivíduo SI_026). (F) Salminus sp. Araguaia (indivíduo não analisado). A barra de escala representa 5 cm. Fotos por (A) W. R. C. Flor, (B) (E) C. Machado. (F) P. Venere. 161

17 LISTA DE TABELAS Capítulo 1 Página Tabela 1 Área de distribuição e locais de coleta de Salminus na América do Sul. 78 Tabela 2 Média das distâncias genéticas, através do modelo de K2P, entre as oito MOTUs de Salminus. Em negrito, na diagonal, são os valores médios das distâncias intramotu. 82 Tabela S1 Informação sobre os números de acesso das sequências COI e RAG2. 87 Tabela S2 Média e máxima distância intraespecífica das espécies de Salminus, baseadas em K2P. 89 Tabela S3 Modelos de evolução nucleotídica para cada partição por posição do códon determinados com Partition Finder 1.1.1, usando critério de informação bayesiana. 89 Capítulo 2 Tabela 1 Probabilidades posteriores de cada cenário estimada usando DIYABC. A maior probabilidade está em negrito. 135 Tabela 2 Valores posteriores dos parâmetros para os cenários com alta probabilidade (Vencedores). A unidade de tempo, contada em geração, foi convertida em 10 6 anos antes do presente (Ma), baseada na média do tempo de geração de 2 anos (De Godoy 1975). 136 Tabela S1 Locais de coleta de Salminus na América do Sul e número de acesso do Genbank. 144

18 Tabela S2 Sequências dos primers empregados neste estudo e a temperatura de anelamento utilizada na PCR. 148 Tabela S3 Probabilidade posterior bayesiana estimada usando DIYABC para cada cenário (Rodada 1 Salminus hilarii). 149 Tabela S4 Distribuição a priori dos parâmetros para cada cenário (Fig. 3). 150 Tabela S5 Taxas de erro tipo I e tipo II estimadas para cada cenário vencedor de cada espécie usando DIYABC. 152

19 LISTA DE ABERVIATURAS E SIGLAS ABC Computação bayesiana aproximada (Approximate Bayesian Computation) BOLD Barcode of Life Database CBOL Consortium for the Barcode of Life COI Citocromo C Oxidase I CRSB Rift Continental do Sudeste do (Continental Rift of Southeastern Brazil) Cytb Citocromo B DCARSF Descontinuidade Crustal do Alto Rio São Francisco DNA Ácido desoxirribonucleico DNAmit DNA mitocondrial ESS Tamanho efetivo da amostragem (Effective Sample Size) GMYC Generalized mixed Yulecoalescent HPD Maior densidade de probabilidade (highest probability density) IB Inferência Bayesiana ICMBio Instituto Chico Mendes de Conservação da Biodiversidade indels Inserções e deleções K2P Kimura 2parâmetros Ma Megaanum matk Maturase K MgCl2 Cloreto de Magnésio MOTU Unidades taxonômicas operacionais moleculares (Molecular Operational Taxonomic Units) MRCA Ancestral comum mais recente (Most Recent Common Ancestor) NJ NeighborJoining NUMT Pseudogenes mitocondriais nucleares (Nuclear mitochondrial DNA segment) OT Ótimo Threshold pb Pares de base PCR Reação em cadeia da polimerase (Polymerase Chain Reaction) RAG2 Recombination Activating Gene 2 rcbl Ribulose bifosfato carboxilase (ribulose1,5,bisphospate carboxylase) SISBIO Sistema de Autorização e Informação em Biodiversidade UES Unidades Evolutivas Significativas

20 SUMÁRIO Página 1. APRESENTAÇÃO FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA Evolução geológica do continente sulamericano e o impacto na formação das bacias hidrológicas Biogeografia histórica e Filogeografia: um contexto para peixes Neotropicais Gênero Salminus: modelo para estudos filogeográficos DNA barcoding: ferramenta para identificação molecular REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS PERGUNTAS E HIPÓTESES OBJETIVOS Objetivo geral Objetivos específicos CAPÍTULO 1: DNA barcoding revela incertezas taxonômicas em Salminus (Characiformes) Resumo Introdução Material e Métodos Material amostrado Extração de DNA, amplificação, purificação e sequenciamento Análise de dados Resultados Discussão Diversidade críptica em S. brasiliensis Diversidade críptica em S. hilarii Conclusões e Aplicação Agradecimentos Referências Bibliográficas Tabelas e Figuras Material suplementar... 87

21 CAPÍTULO 2: Testando cenários biogeográficos: Abordagem bayesiana revela história evolutiva de peixes Neotropicais Resumo Introdução Material e Métodos Amostragem de dados moleculares Inferência filogenética Estimativas de tempos de divergência Testando cenários biogeográficos com Approximate Bayesian Computation Definindo cenários Distribuição dos priors dos parâmetros e estatísticas sumárias Comparação de cenários Estimativa e precisão dos parâmetros e checagem do modelo 104 Resultados Relações filogenéticas entre as espécies de Salminus Tempos de divergência entre as espécies de Salminus Testando hipóteses biogeográficas com análise ABC para S. brasiliensis, S. hilarii, e S. sp. Amazonas e S. sp. Araguaia Discussão Filogenia de Salminus História evolutiva de Salminus Approximate Bayesian Computation e teste de hipóteses biogeográficas Agradecimentos Referências Bibliográficas Biosketch Tabelas e Figuras Material suplementar CONSIDERAÇÕES FINAIS Referências Bibliográficas CONCLUSÕES

22 8. APÊNDICE Apêndice

23 20 1. Apresentação Popularmente conhecidos como dourados e tabaranas, Salminus é constituído por peixes predadores de médio e grande porte, que realizam migrações reprodutivas e apresentam grande importância na pesca comercial e esportiva. Atualmente, está constituído por quatro espécies válidas distribuídas nas bacias hidrográficas sulamericanas, principalmente brasileiras. Contudo, o status taxonômico de algumas espécies é questionável, principalmente devido às variações morfológicas intraespecíficas. A monofilia do gênero é evidente e bem suportada por dados moleculares e morfológicos. Entretanto as relações intragenéricas são difíceis de compreender. Apesar da importância comercial e ecológica apresentada pelas espécies de Salminus, o conhecimento taxonômico, filogenético e filogeográfico ainda são escassos. As informações geradas através do presente estudo não responderão apenas perguntas relacionadas à validade taxonômica das espécies, às relações evolutivas entre elas e aos prováveis eventos biogeográficos que geraram a especiação desses organismos, mas principalmente auxiliarão programas de conservação em áreas ameaçadas. Isso porque peixes migradores são considerados espécies guardachuva, ou seja, organismos que requerem uma área extensa de habitat, sendo importantes candidatos no planejamento e monitoramento da conservação da biodiversidade, sob a perspectiva de que preservar populações viáveis destas espécies é preservar inúmeras outras espécies com necessidades de área menor. Para melhor apresentar o conteúdo do nosso estudo, a tese foi dividida em uma fundamentação teórica, contendo informações que nos ajudarão a compreender algumas lacunas do conhecimento sobre o gênero Salminus, seguida de dois capítulos, em formato de artigos científicos, redigidos de acordo com as exigências dos periódicos de interesse. O capítulo 1, intitulado DNA barcoding revela incertezas taxonômicas em Salminus (Characiformes), demonstra a eficácia da metodologia do DNA barcoding em identificar que os polimorfismos intraespecíficos observados previamente em estudos morfológicos são resultados de problemas taxonômicos que necessitam ser avaliados. Nesse capítulo, o objetivo foi sinalizar quais espécies apresentavam esses problemas e como essas informações podem auxiliar no status de conservação do gênero. O artigo encontrase aceito na revista Systematics and Biodiversity. Uma informação importante, é que esse artigo será tratado no capítulo 2 como Machado et al. (no prelo). O capítulo 2, intitulado Testando cenários biogeográficos: Abordagem bayesiana revela história evolutiva de peixes Neotropicais, aborda outras importantes lacunas do

24 21 gênero: filogenia e filogeografia. Apesar de uma filogenia molecular ter sido publicada (Abe et al., 2014), ela apresenta incongruências com os nossos dados, o que nos permitirá avaliar e discutir sobre essas diferenças. O mesmo ocorre para a filogeografia, onde os autores sugerem processos de divergência das espécies diferentes do que estamos propondo. Um aspecto importante e diferencial desse capítulo será a utilização da abordagem bayesiana para testar hipóteses filogeográficas alternativas. Pela primeira vez, um estudo desse tipo é realizado em representantes da ictiofauna neotropical. Posterior a apresentação desses capítulos, faremos nossas considerações finais, descrevendo as implicações para a conservação do gênero e para história evolutiva da ictiofauna neotropical. Todas as seções dessa tese contêm suas próprias referências bibliográficas. E, finalmente, haverá uma secção de conclusões onde as principais contribuições para ultrapassar a fronteira do conhecimento sobre o gênero Salminus serão apresentadas em tópicos.

25 22 2. Fundamentação teórica 2.1 Evolução geológica do continente sulamericano e o impacto na formação das bacias hidrológicas Compreender a evolução dos sistemas de drenagem modernos é fundamental para discutir sobre os prováveis processos de diversificação da ictiofauna. O dinamismo dos sistemas hidrográficos, com rupturas e coalescência das bacias, é o principal promotor dos eventos de especiação dos organismos de água doce (ALBERT; REIS, 2011). Por essa razão, a história de algumas das principais bacias sulamericanas será brevemente discutida e relacionada a eventos tectônicos e climáticos do continente que influenciaram o desenvolvimento de suas modernas configurações. A principal estrutura geológica da região Neotropical é a Plataforma sulamericana, porção estável que ocupa 62% da placa continental moderna e que não é afetada pelas zonas orogênicas (regiões onde ocorrem os processos de formação das cadeias montanhosas) (ALBERT; REIS, 2011). É nessa porção onde encontramos estruturas geológicas importantes que moldaram o padrão das drenagens, como os Escudos Cristalinos (eiro e das Guianas). Ainda na porção continental da Placa América do Sul é possível observar a Cordilheira dos Andes, a bacia Antepaís (região de acúmulo de sedimentos, pouco deformada pelo processo tectônico e que está adjacente aos Andes), além de vários arcos estruturais (Figura 1) (LUNDBERG et al., 1998). Dois eventos geológicos foram chaves na reorganização da paisagem hidrogeológica: (1) A quebra da Gondwana (tratado, nessa etapa geológica, como o supercontinente formado por África e América do Sul), que se iniciou há 130 Ma (Megaanum, unidade de tempo equivalente a um milhão de anos) 1 e culminou há 90 Ma. Esse processo resultou no isolamento entre África e América do Sul e na abertura do oceano Atlântico. (2) E, a formação da cordilheira dos Andes, resultada da compressão tectônica das placas Nazca e América do Sul. O processo se iniciou há 90 Ma e ao longo de sua história apresentou múltiplas fases de elevação tectônica que atuaram ativamente no remodelamento da paisagem (LUNDBERG et al., 1998). 1 A escala do tempo geológico abordada nesse trabalho está de acordo com Comissão Internacional sobre Estratigrafia (COHEN et al., 2013).

26 Figura 1 Características geológicas e topográficas da Placa sulamericana. As letras representam alguns dos principais arcos estruturais da América do Sul: (a) Arco de Gurupa, (b) Arco de Purus, (c) Arco de Vaupes e (d) Arco de Michicola. As setas vermelhas indicam o sentido de deslocamento das placas tectônicas (Modificado de LUNDBERG et al., 1998). 23 Pouco se sabe sobre os padrões das paleobacias 2 no período anterior à quebra da Gondwana. É provável que muitas bacias conhecidas atualmente não existissem devido ao clima árido e semiárido no interior do continente (POTTER, 1997). Algumas paleodrenagens do sul do continente, originadas nos escudos cristalinos, apresentavam direção diferente da atual, percorrendo rumo ao oceano Pacífico. Porém, com a completa abertura do oceano Atlântico (aproximadamente há 90 Ma), a região central do Andes iniciou seu processo de soerguimento. Essa elevação na porção oeste do continente afetou a direção das paleodrenagens, redirecionandoas para o Atlântico (SMITH; SMITH; FUNNELL, 1994). Uma paleodrenagem que não mudou seu curso, em decorrência desse evento, foi o paleo Amazonas, que continuou com seu sentido para oeste. Isso aconteceu porque a atual vazão para o Atlântico estava interrompida pelo Rift do Marajó durante o Cretáceo. Com a elevação 2 Termo que será empregado para designar uma configuração antiga das atuais bacias hidrográficas.

27 24 progressiva dos Andes no Paleoceno, o paleorio foi redirecionado para o leste, porém, o surgimento do arco de Purus, na porção mediana do curso atual do Amazonas, impediu a mudança de trajeto (LUNDBERG et al., 1998). Inclusive, o arco de Purus dividiu a bacia do paleoamazonas em duas porções: leste (que desaguava no oceano Atlântico) e oeste (que desaguava no Mar do Caribe). Esta divisão continuará até a erosão dessa estrutura durante o Mioceno Superior (~8 Ma) (COSTA et al., 2001; LUAN; ARMBRUSTER, 2011). Concomitantemente aos processos de separação da Gondwana e início da formação dos Andes, as incursões marinhas também modelavam as paleodrenagens. Durante o Cretáceo Superior (8367 Ma) e metade do Paleoceno (6160 Ma) o nível do mar aumentou aproximadamente 100 metros (m), inundando as terras baixas e assim reduzindo as áreas das paleobacias (Figura 2). É durante o intervalo entre essas duas incursões que ocorre o estabelecimento dos sistemas de drenagem que foram considerados os ancestrais da porção oeste do AmazonasOrinocoMagdalena e do ParanáParaguai. A primeira paleobacia tem seu curso para o norte (as primeiras elevações dos Andes fecham a sua passagem para o Oceano Pacífico, sendo desviada para o Mar do Caribe), enquanto a segunda tem direção oposta, desaguando no sul do Atlântico (LUNDBERG et al., 1998). Até a formação do Arco de Michicola (~10 Ma LUNDBERG et al., 1998), não haverá uma barreira impermeável entre essas paleobacias adjacentes. Por essa razão, ambas experimentarão sucessivos eventos de capturas de cabeceira, que permitirão trocas de fauna aquática importantes para o processo de diversificação de vários grupos de peixes (TAGLIACOLLO et al., 2015). Com o progressivo soerguimento da porção Central dos Andes, durante a metade do Eoceno (43 Ma), a bacia Antepaís passa a ser ocupada pelo lago Pozo (4330 Ma), predecessor ao famoso lago Pebas. Outro importante evento dessa época é a perda de uma barreira semipermeável (Serras Pampeanas) entre as paleodrenagens Amazonas e Paraná Paraguai, resultando em uma grande captura da cabeceira do paleoamazonas por parte do paleoparanáparaguai. Entre o Oligoceno Superior e na metade do Mioceno (3020 Ma), outra barreira temporária surge entre essas paleobacias. A formação de Chapare Buttress, originada a partir do contato dos Andes com a porção oeste do escudo brasileiro, permanece até ~10 Ma, quando ambas as bacias se separam permanentemente (LUNDBERG et al., 1998).

28 δ 18 O Figura 2 Estimativas no nível do mar derivadas a partir de Nova Jérsei (EUA) que providenciam um registro global para os últimos 100 Ma e como interferiram na paisagem hidrológica sulamericana entre Ma. As diferentes cores representam as fontes bibliográficas de onde os dados foram retirados: laranja Kominz et al., (2008); azul Miller et al. (2005) e roxo Lisiecki e Raymo (2004). Modificado a partir de Miller et al. (2011). 25 Durante os períodos de rápida compressão da placa Nazca (9075 Ma, 5040 Ma e 25 0 Ma), as falhas geológicas da costa leste do continente sulamericano, que forma um conjunto denominado de Rift Continental do Sudeste do (CRSB), eram reativadas (COBBOLD et al., 2001). Originado no Jurássico Superior ( Ma), o CRSB evoluiu sucessivamente para a ruptura continental e abertura do Oceano Atlântico (RICCOMINI et al., 2004). As reativações geológicas do CRSB foram eventos tectônicos significativos na modelagem das bacias costeiras, uma vez que promoveram inúmeras capturas de cabeceira entre essas bacias e as bacias do escudo brasileiro (RIBEIRO, 2006). Um exemplo interessante, resultante dessas ativações, é o da paleobacia do rio Tietê, que desaguava no oceano Atlântico, juntamente com a paleobacia do Alto Paraíba do Sul, e teve seu curso

29 26 alterado, após uma reativação tectônica, para o interior do continente, passando a fazer parte da bacia do Alto rio Paraná (AB SABER, 1957). A paisagem do noroeste do continente, a partir do Mioceno inferior (20 Ma), começa a mudar com o início do soerguimento da porção norte dos Andes e com as novas incursões marinhas. A principal característica desse período é uma bacia Antepaís com extensos lagos de águas doce (Sistema Pebas), alimentados por paleorios provenientes dos Andes e escudos cristalinos, que se conectam a áreas sob influência marinha (mar Pebasian) (LUNDBERG et al., 1998). Do ponto de vista ictiológico, essa porção do continente foi muito diferente do que é hoje, devido ao dinamismo de ecossistemas (dulcícola e marinho). Em ciclos de incursões marinhas mais extensivas, a água do mar invadia o sistema Pebas, promovendo extinções e eventos de vicariância entre as espécies de água doce. Vários grupos, como as arraias e alguns cianídeos, tornaramse adaptados ao ambiente de água doce e rapidamente se irradiaram (LOVEJOY; BERMINGHAM; MARTIN, 1998; LOVEJOY; DE ARAÚJO, 2000). Os processos de elevação da cordilheira oriental dos Andes na metade do Mioceno (~12 Ma) e dos Andes de Méridas no Mioceno superior (~8 Ma) culminaram na delimitação das fronteiras das drenagens modernas na porção Noroeste da América do Sul, incluindo Oeste do Amazonas, Orinoco, Maracaibo e Magdalena (ALBERT; LOVEJOY; CRAMPTON, 2006). A cadeia oriental dos Andes isolou o paleomagdalena do paleoamazonasorinoco, tornandose o evento promotor da diversificação da ictiofauna cis e transandina. Os Andes de Méridas limitou o paleomaracaibo do paleoorinoco. E, a formação do Arco de Vaupes (~10.5 Ma), tornouse a barreira entre a bacia do paleoamazonas e do paleoorinoco. Essa última estrutura bloqueou o fluxo do Lago Pebas para o Mar do Caribe. Sem ter para onde escoar, as águas acumuladas rompem o arco de Purus, resultando no estabelecimento do atual curso do Amazonas (LUNDBERG et al., 1998). Os estágios finais para os modernos padrões hidrológicos são caracterizados pelas oscilações climáticas (PlioPlestoceno, 50.1 Ma), que resultaram em novos ciclos de incursão e regressão marinha, e sucessivas reativações neotectônicas. Os ciclos marinhos afetaram principalmente a foz do Amazonas (LUNDBERG et al., 1998) e as bacias costeiras do Leste (RIBEIRO, 2006). Já as reativações promoveram a separação do TocantinsAraguaia e Amazonas ( Ma) (ROSSETTI; VALERIANO, 2007) e o surgimento do Pantanal (2.5 Ma) (RIBEIRO et al., 2013). A formação do Istmo do Panamá (~3 Ma), que apesar de não influenciar a disposição das drenagens do continente, também foi um importante evento de enriquecimento de ictiofauna da região noroeste (BERMINGHAM; MARTIN, 1998).

30 27 Entre as grandes bacias brasileiras, o Alto rio Paraná, Paraguai, Uruguai, São Francisco e muitos rios costeiros, como o Doce e Jequitinhonha, adquiriram seu curso atual como resultado do tectonismo associado com a quebra da Gondwana (POTTER, 1997; RIBEIRO, 2006). Para essas bacias, as reativações neotectônicas tiveram e ainda têm um importante papel no rearranjo de suas configurações resultando em vários eventos de capturas de cabeceiras entre as bacias adjacentes. Essas reativações foram também responsáveis pela formação de algumas corredeiras e cachoeiras que funcionam como barreira vicariante entre áreas de um mesmo rio como as Corredeiras do Teotônio (rio Madeira), Cataratas do Iguaçu e a extinta Catarata de Sete quedas (LOVEJOY et al., 2010). Em suma, a formação do divisor andino e de outras estruturas geológicas, mudanças de curso de rios e repetidas incursões e regressões marinhas produziram inúmeros eventos de divergência alopátrica e geodispersão 3 no últimos 90 Ma. Portanto, as principais hipóteses de diversificação da ictiofauna abordarão esses elementos como explicação da origem e manutenção da biodiversidade Neotropical. 2.2 Biogeografia histórica e Filogeografia: um contexto para peixes Neotropicais A biogeografia é um campo da ciência que analisa a distribuição geográfica dos organismos ao longo do tempo (LOMOLINO; SA; BROWN, 2004). A disciplina tem raízes científicas profundas, com alguns grandes temas já estabelecidos desde o início dos anos de 1800 (WHITTAKER et al., 2005). Apresenta uma abordagem descritiva, que objetiva apenas reconhecer os padrões de distribuição, e uma interpretativa, quando busca explicações para tais padrões que podem ser resultados de fatores ecológicos (Biogeografia ecológica) ou históricos (Biogeografia histórica) (POSADAS; CRISCI; KATINAS, 2006). A principal diferença entre a Biogeografia ecológica e histórica está no contexto espaçotemporal. Enquanto os processos ecológicos ocorrem em uma curta escala espaçotemporal, os processos históricos ocorrem em espaço global durante milhões de anos (CRISCI; KATINAS; POSADAS, 2003). A abordagem histórica considera dispersão, vicariância e extinção como processos que afetam igualmente a distribuição dos organismos (POSADAS; CRISCI; KATINAS, 2006). A existência sobre os processos de extinções tem sido aceita amplamente pela comunidade 3 Termo cunhado por Lieberman (2000) e significa a expansão da área limite de um grupo de espécies devido a eliminação temporária de uma barreira.

31 28 científica, o que não é o caso dos outros dois. A vicariância é definida como um evento em que uma população ancestral é dividida em subpopulações devido ao desenvolvimento de uma barreira impermeável (o fluxo gênico é interrompido). Essa barreira pode ser topográfica, aquática, oceânica, tectônica, ambiental, climática ou biótica (WILEY, 1988). Já a dispersão pode ser diferenciada em duas: a dispersão biológica, parte da população ancestral ultrapassa uma barreira préexistente, colonizando uma nova área, e a geodispersão. O padrão biogeográfico da geodispersão e da vicariância envolve múltiplos taxa. Por outro lado, a dispersão biológica envolve apenas um ou poucos grupos de espécies (HO et al., 2015). Consideradas hipóteses conflitantes, vicariância e geodispersão são os processos alopátricos mais discutidos dentro da evolução da ictiofauna sulamericana (CRISCI; KATINAS; POSADAS, 2003; MONTOYABURGOS, 2003). Com o advento de dados moleculares e métodos de bioinformática para analisar as diferenças genéticas em nível populacional, novos conhecimentos sobre a ictiofauna dulcícola neotropical foram adicionados. A abordagem genética permitiu o surgimento da filogeografia como uma subdisciplina da biogeografia (AVISE, 2000), tornandose uma ferramenta poderosa especialmente em casos de incertezas taxonômicas, proporcionadas pela existência de espécies crípticas, plasticidade fenotípica e falta de clareza na taxonomia morfológica, além de calibrações temporais das filogenias, ajudando a compreender a cronologia dos eventos de divergência das linhagens (ou níveis superiores). A filogeografia examina os processos que afetaram a estrutura genética das linhagens genealógicas, especialmente dentro e entre espécies estreitamente relacionadas, incluindo os efeitos da dinâmica da paisagem, eventos de dispersão ou geodispersão e prováveis extinções locais (AVISE, 2000). A ictiofauna dulcícola da região Neotropical é a mais rica do mundo com mais de 5000 espécies descritas (REIS et al., 2016). As razões para os prováveis mecanismos que promoveram e mantiveram esses altos níveis de diversidade são principalmente históricas e estão associadas, como visto anteriormente, ao desenvolvimento dos sistemas de drenagens modernos (LUNDERG et al., 1998). Entre as primeiras hipóteses a serem sugeridas, destacase as flutuações climáticas ocorridas durante o Pleistoceno, que fragmentava e reconectava habitats, promovendo especiação alopátrica. Essa hipótese é conhecida como Teoria do Refúgio e foi proposta por Haffer (1982). No entanto, apesar de outros trabalhos suportarem essa teoria (RENNO et al., 1990; HUBERT et al., 2007a), registros fósseis assinalaram que a diversificação de vários grupos de peixes modernos prédatava o Pleistoceno (LUNDBERG, 1997), ou seja, a teoria do refúgio era uma explicação pontual para alguns grupos (WEITZMAN; WEITZMAN,

32 ). Rull (2008), a partir de uma metaanálise, em que utilizou mais de 300 referências para avaliar quando e quais fatores levaram a diversificação espécies Neotropicais, também suporta essa ideia. Segundo o autor, 80% das unidades evolutivas significativas (UES) de peixes neotropicais que foram avaliadas surgiram antes do Pleistoceno. As evidências moleculares indicam que importantes eventos de diversificação ocorreram entre 12 e 3 milhões de anos (ABE et al., 2014; ALBERT; LOVEJOY; CRAMPTON, 2006; BERMINGHAM; MARTIN, 1998; HUBERT et al., 2007b; LOVEJOY; DE ARAÚJO, 2000; MONTOYA BURGOS, 2003; ROO et al., 2014; SIVASUNDAR; BERMINGHAM; ORTI, 2001; TAGLIACOLLO et al., 2015). Atualmente, existem três principais hipóteses, baseadas em processos paleoecológicos, que aconteceram durante esse período e que resultaram em eventos de especiação alopátrica: (i) hipótese Paleogeográfica (surgimento de uma barreira a partir de rearranjo tectônico, por exemplo, os paleoarcos, antigas cadeias de montanha, resultadas da dinâmica da formação dos Andes), (ii) hipótese Hidrogeológica (eventos de captura de cabeceiras gerando rotas temporárias de geodispersão) e (iii) a hipótese do Museu (incursões marinhas do Mioceno, gerando refúgios nos piemontes de regiões montanhosas). A especiação simpátrica teoricamente é possível, porém estudos empíricos são escassos, existindo poucos eventos convincentes. Para a região Neotropical apenas dois exemplos são reconhecidos: a heterogeneidade de habitat encontrada na subbacia do rio Madeira (bacia do rio Amazonas) acarretou na diversificação de três espécies do gênero Serrasalmus (HUBERT et al., 2007b); e, ciclídeos do gênero Amphilophus, presentes no Lago Nicarágua, que diversificaram por mecanismo ecológicos, como preferência de habitats na coluna d água e utilização diferenciada de recursos (BARLUENGA et al., 2006). As predições filogenéticas para a hipótese Paleogeográfica é que linhagens/espécies de bacias separadas por uma barreira geológica formam cladosirmãos, representando um evento clássico de especiação por vicariância (HUBERT; RENNO, 2006). Esse padrão é constantemente encontrado no noroeste da América do Sul, região que sofreu bastante com a dinâmica da formação dos Andes (ALBERT; LOVEJOY; CRAMPTON, 2006; MONTOYA BURGOS, 2003). O evento de vicariância mais discutido nessa hipótese é entre a ictiofauna cis e transandina originada após o soerguimento da cadeia oriental dos Andes (ALBERT; LOVEJOY; CRAMPTON, 2006; SIVASUNDAR; BERMINGHAM; ORTI, 2001). Processos secundários, como a formação dos paleoarcos também contribuiriam com a diversificação por vicariância na Amazônia. Hubert e Renno (2006), através de uma compilação de dados de distribuição de diversos táxons da ordem Characiformes, sugeriram que o Arco de Vaupes e de Michicola foram os responsáveis pela divisão ictiofaunística do OrinocoAmazonas e

33 30 AmazonasParaná, respectivamente. Hubert et al. (2007b), também suportam a grande importância da formação dos paleoarcos na diversificação dos gêneros Pygocentrus e Serrasalmus. No caso da hipótese Hidrogeológica, eventos de geodispersão, promovidos por captura de cabeceira, são os responsáveis pela diversificação da ictiofauna. É um caso especial de evolução da paisagem com formação e remoção de barreiras entre drenagens adjacentes. A assinatura biogeográfica desse evento é o nãomonofiletismo entre linhagens/espécies de bacias adjacentes (MONTOYABURGOS, 2003; TAGLIACOLLO et al., 2015). Capturas de cabeceira são comumente observadas em áreas geológicas estáveis (escudos cristalinos), que estão cobertas de fraturas e falhas geológicas. As contínuas reativações tectônicas dessas áreas (datadas desde o Paleogeno, 66 Ma) promoveram rearranjos entre as bacias, resultando em eventos de captura de cabeceira e geodispersão da ictiofauna (RIBEIRO, 2006; ROO et al., 2014). MontoyaBurgo (2003), estudando os processos de diversificação do gênero Hypostomus observou eventos hidrogeológicos entre Amazonas e os rios costeiros do Nordeste, promovidos pelo o recuo do mar seguido de coalescência das drenagens (65Ma); no Escudo brasileiro eventos de captura entre o Alto rio Paraná e o rio São Francisco também ocorreram no mesmo período; e, entre o Alto rio Paraná e os rios costeiros (BUCKUP, 2011). Este último evento é bem discutido por Ribeiro (2006). Hubert e Renno (2007b) evidenciaram uma extensa área de ramificação envolvendo o Alto Madeira (Guaporé, Mamoré, Madre de Dios), TocantinsAraguaia, Paraguai e Tapajós que providencia uma oportunidade para a geodispersão da ictiofauna, através de sucessivos eventos de captura. Esses resultados também são consistentes com os achados de Sivasundar et al. (2001), Carvalho e Albert (2011) e Roxo et al. (2014). Na hipótese do Museu, as espécies amplamente distribuídas apresentam linhagens basais presentes nos escudos cristalinos eiro e das Guianas. Isso ocorre porque as incursões marinhas (aumentando o nível do mar em 100 metros) ocorridas no Mioceno (205 Ma) fragmentaram o habitat, e isolaram as populações nessas áreas altas, extinguindo as de terra baixa. Já as linhagens de terras baixa surgiram após as regressões marinhas (últimos 5 Ma) (HUBERT et al., 2007b). Segundo Hubert e Renno (2006), a assinatura biogeográfica seria de áreas elevadas com altos níveis de endemismo (chamadas de refúgio), enquanto as áreas baixas teriam alta diversidade de espécies, porém baixos níveis de endemismo. Essas predições foram confirmadas para os gêneros Serrasalmus e Pygocentrus (HUBERT et al., 2007b), Plagioscion (COOKE; CHAO; BEHEREGARAY, 2011), para espécies da subfamília

34 31 Hypoptopomatinae, Neoplecostominae e Otothyrinae (ROO et al., 2014) e para alguns eventos de diversificação da família Bryconidae (ABE et al., 2014). Apesar desse incremento de informação em estudos biogeográficos a origem da ictiofauna sulamericana é ainda amplamente debatida. Devido à grande complexidade de padrões biogeográficos da região, não há concordância sobre a generalidade de algumas dessas explicações, nem se elas são mutuamente exclusivas (HUBERT; RENNO, 2006). Portanto, visando oferecer insights sobre a história biogeográfica da região Neotropical, utilizaremos como modelo biológico as espécies do gênero Salminus. Conforme será discutido no próximo tópico, a escolha desse grupo se baseia em características importantes para estudos filogeográficos dessa região como o monofiletismo, grande capacidade migratória e a ampla distribuição na América do Sul. 2.3 Gênero Salminus: organismo modelo para estudos filogeográficos Popularmente conhecido no como tabarana e dourado, Salminus pertence a ordem Characiformes e está constituído por peixes de médio e grande porte, que realizam migrações reprodutivas durante o período das chuvas e possuem importância na pesca comercial, de subsistência e esportiva. Estão distribuídos amplamente nas principais bacias hidrográficas sulamericanas (Figura 3), onde são encontrados em ambientes lóticos (rios de primeira e segunda ordem). Nos estágios iniciais de desenvolvimento, as espécies do gênero em vida livre são planctívoras e quando adultos apresentam comportamento predatório desempenhando, assim, um papel fundamental na dinâmica, no funcionamento e estrutura dos ecossistemas aquáticos (ESTEVES; PINTOLOBO, 2001; LIMA; BRITSKI, 2007; RODRÍGUEZOLARTE; TAPHORN., 2006). A história taxonômica do grupo é bem complexa e contraditória (LIMA; BRITSKI, 2007). Atualmente, quatro espécies são consideradas válidas (LIMA et al., 2003; LIMA; BRITSKI, 2007 ver imagens das espécies no Apêndice 1, AD): Salminus affinis (Steindachner, 1880 holótipo proveniente do rio Cauca): restrita às bacias transandinas do rio Magdalena, Ranchería e Sinú, Colômbia; Salminus brasiliensis (Cuvier, 1816 holótipo proveniente do rio Cuiabá): presente ao longo de toda bacia Platina (Argentina, Paraguai, Uruguai e ); sistema do rio Iguaçu, Jacuí, Lagoa dos Patos, todos no sul do ; Salminus franciscanus (Lima e Britski, 2007 holótipo proveniente do rio São Francisco): Espécie descrita recentemente. É endêmica da bacia do rio São Francisco;

35 32 Salminus hilarii (Valenciennes, 1850 holótipo proveniente do rio São Francisco): encontrada nas bacias dos rios São Francisco, Alto Paraná, TocantinsAraguaia, Alto Amazonas e Orinoco. Figura 3 Distribuição geográfica das espécies de Salminus. (A) Salminus affinis. (B) Salminus brasiliensis. (C) Salminus hilarii. (D) Salminus franciscanus. As cores representam as diferentes bacias hidrográficas sulamericanas. Em dados não publicados, Lima (2006) revela distinta morfologia entre espécimes de S. hilarii proveniente das bacias do rio São Francisco e Alto rio Paraná (chamaremos de grupo leste) em comparação aos espécimes encontrados nas bacias do TocantinsAraguaia, Alto Amazonas e Orinoco (denominaremos de grupo oeste). Segundo Lima (2006), os espécimes do grupo oeste podem ser diferenciados das demais espécies pela presença de pequenas e

36 33 numerosas listras escuras longitudinais, concentradas na porção média e central da nadadeira caudal. Com essa sinapomorfia, o autor propõe ressuscitar, para os espécimes do grupo oeste, o uso do nome Salminus iquitensis (nova combinação feita a partir de Holobrycon iquitensis NAKASHIMA, 1941), considerado erroneamente por autores mais antigos (ver LIMA, 2006) como sinônimo de S. hilarii e assim influenciando diversos outros autores (MALDONADO OCAMPO; VARI; USMA, 2008; SILVANO et al., 2001; WRIGHT; FLECKER, 2003). Dados moleculares também corroboram a hipótese de que os grupos leste e oeste são unidades taxonômicas diferentes (ABE et al., 2014). Entretanto, como o S. iquitensis não foi ressuscitado, não iremos considerálo como espécie neste trabalho. Além desse problema taxonômico, outras incertezas permeiam a classificação das espécies do gênero como as variações morfológicas intraespecíficas. Shibatta e Garavello (1993), analisando espécimes de S. hilarii da bacia do rio São Francisco e Alto rio Paraná, sugeriram que as diferenças morfológicas encontradas na análise de componentes principais são suficientes para separar os espécimes de cada bacia em unidades taxonômicas distintas. A espécie S. brasiliensis também apresenta registros de variação morfológica. Rosso et al. (2012), usando caracteres merísticos e morfológicos, juntamente com dados moleculares mitocondriais (DNAmit), concluíram que espécimes coletados na Planície dos Pampas (Argentina) constituem uma nova unidade taxonômica distinta das demais espécies de Salminus. Em contraste, Lima (2006) afirma que, apesar dos polimorfismos morfológicos observados em seu trabalho, não há evidências que permita diagnosticar a presença de novas espécies. O autor justifica que as variações entre as populações decorrem da ampla e disjunta distribuição das espécies e que uma análise morfométrica mais precisa e um estudo filogeográfico são essenciais para a elucidação destas dúvidas. Se a taxonomia de Salminus inspira cuidados, as relações filogenéticas com os demais Characiformes são ainda mais difíceis de serem estabelecidas. Apesar de ter sido proposta a subfamília Salmininae (EIGENMANN, apud LIMA, 2006), Lima et al. (2003) classificaram Salminus, juntamente com outros 87 gêneros da família Characidae, como incertae sedis (termo da Taxonomia que significa posição incerta, quer dizer sem atribuição de subfamília). Mirande (2010) analisando 360 caracteres, removeu o gênero do grupo proposto por Lima et al. (2003) e o classificou novamente em sua própria subfamília. Dados moleculares também corroboraram essa hipótese (JAVONILLO et al., 2010). Entretanto, Géry (1977), Ortí e Meyer (1997) e Calcagnotto et al. (2005) sugeriram que a estreita relação 4 EIGENMANN, C. H. The American Characidae [Vol. I]. Memoirs of the Museum of Comparative Zoology, v. 43, n. 1, p. 1102, 1917.

37 34 observada, inclusive em dados citogenéticos (MARGARIDO; GALETTI, 1999) entre Salminus e Brycon não era de monofilia recíproca (gêneros irmãos), mas sim porque Salminus está interespaçado entre as espécies de Brycon, constituindo a subfamília Bryconinae. Mais recentemente, Abe et al. (2014), corroborando com Oliveira et al. (2011), promoveram um novo rearranjo realocando o gênero Salminus para família Bryconidae, juntamente com os gêneros Chilobrycon, Henochilus e Brycon, este último é o único gênero não monofilético. A monofilia de Salminus é evidente e bem suportada por dados moleculares e morfológicos (15 sinapomorfias) (ABE et al., 2014; CALCAGNOTTO; SCHAEFER; DESALLE, 2005; JAVONILLO et al., 2010; LIMA, 2006; OLIVEIRA et al., 2011). As relações intragenéricas entre as espécies revelam S. hilarii (grupo leste) como a espécieirmã das demais (Figura 4A). S. brasiliensis e S. franciscanus formam espéciesirmãs assim como S. affinis e S. sp. (= S. iquitensis = S. hilarii, grupo oeste) (ABE et al., 2014). Esse cenário é semelhante ao proposto por Lima (2006), que apesar de utilizar 69 caracteres morfológicos e apenas três apresentarem variações, identificou estreitas relações entre S. brasiliensis e S. franciscanus, e S. affinis e S. iquitensis (= S. hilarii, grupo oeste) (Figura 4B). Figura 4 Relações intragenéricas entre as espécies de Salminus, (A) baseadas em dados moleculares (ABE et al., 2014) e (B) dados morfológicos (LIMA, 2006). Quanto ao status de conservação, todas as espécies de Salminus estão passando por um severo declínio populacional resultante da pesca predatória, introdução de espécies e, principalmente, fragmentação de habitat (construção de barragens hidrelétricas) (AGOSTINHO, 1999; CAROLSFELD, 2003). Apesar desse cenário alarmante, nenhuma das espécies válidas, presentes no território brasileiro, está inclusa em listas de espécies ameaçadas internacional (IUCN, 2014) e nacional (IBAMA, 2014). A ausência de uma clara delimitação taxonômica resultou em uma negligência na organização das listas. Diante desse complexo cenário taxonômico e da necessidade de rápida resolução para estabelecimento de políticas de conservação, Salminus é um grupo de peixes Neotropicais que

38 pode se beneficiar com a abordagem do DNA barcoding, um sistema de identificação molecular de espécies (HEBERT et al., 2003) DNA barcoding: ferramenta para identificação molecular Historicamente, os métodos de identificação, denominação e classificação dos peixes, assim como ocorre com Salminus, estão baseados na morfologia externa. Entretanto, essa abordagem apresenta limitações que resultam em erros de identificação de espécies, quando: há a ocorrência de plasticidade fenotípica, presença de espécies crípticas, as chaves de identificação utilizadas frequentemente demandam de um alto nível de expertise e caracteres morfológicos considerados diagnóstico são efetivos apenas em um tipo específico de estágio de vida e gênero (HEBERT et al., 2003). Com esses impedimentos, associados também à diminuição na formação de novos taxonomistas (processo conhecido como impedimento taxonômico ), tornouse necessário o surgimento de uma nova abordagem para auxiliar na diagnose do status taxonômicos dos organismos. A identificação de espécies através de outras ferramentas, como por exemplo, análises moleculares, tem sido utilizada há anos. Inicialmente, foram empregadas diferenças proteicas (MANWELL; BAKER, 1963), seguidas de análises citogenéticas (PETITPIERRE, 1996), chegando até a divergência de sequências de DNAmit (AVISE, 1994) e nuclear (SEVILLA et al., 2007). O uso da distância genética para essa finalidade foi discutido por Ferguson (2002). Segundo o autor, com algumas exceções, uma distância genética suficiente reflete um acúmulo de diferenças genéticas em vários loci ao longo do tempo, acarretando uma incompatibilidade genética entre os organismos e criando assim um isolamento reprodutivo (base para o conceito biológico de espécie). Diante dessa ideia, Hebert et al. (2003) propuseram, através do emprego de um marcador molecular mitocondrial, a criação de um sistema de bioidentificação global de animais, denominado DNA barcoding. Segundo os autores, cada espécie analisada apresentaria um código de barras (barcode) próprio, um fragmento do gene Citocromo C Oxidase I (COI), que seria utilizado como uma ferramenta auxiliar na correta identificação taxonômica dos organismos e no aumento da descoberta de novas espécies (HEBERT et al., 2003; MORITZ; CICERO, 2004). A princípio não havia nenhuma razão para focar as análises em um gene específico, porém se uma região mitocondrial que codificasse proteína fosse escolhida, esta resultaria em características importantes para a metodologia: ausência de íntrons, ocorrência rara de recombinação e ausência de inserções e deleções (indels). O gene COI foi escolhido porque

39 36 além dessas características, apresentava duas outras vantagens: existência de primers universais robustos, amplificando em muitos, se não todos, os filos animais (FOLMER et al., 1994; ZHANG; HEWITT, 1997) e a variação do sinal filogenético apresentada pelo gene permitiria discriminar não apenas espécies estreitamente relacionadas, mas também grupos filogeográficos dentro da mesma espécie (HEBERT et al., 2003). Dados da literatura também sugerem outros segmentos gênicos sendo utilizados em animais com o mesmo fim, como 16S e o citocromo B (VENCES et al., 2005; SEVILLA et al., 2007). Para plantas, as baixas taxas de substituições do DNA mitocondrial levaram à procura de regiões alternativas do genoma para o DNA barcoding. A CBOL Plant Working Group (2009) recomendou, após a avaliação de sete regiões candidatas do genoma dos plastos, que a combinação de duas regiões (rcbl ribulose bifosfato carboxilase e matk maturase K) providenciaria uma identificação universal para as plantas terrestres. A metodologia ganhou relevância em 2004, após a criação do Consortium for the Barcode of life (CBOL). Essa iniciativa internacional tem como objetivo desenvolver novos instrumentos e processos que torne a metodologia barata, rápida e fácil de utilizar. Por se tratar de um sistema de bioidentificação global, o primeiro passo foi o desenvolvimento de um banco de dados contendo sequências do gene COI (perfiscoi) da biodiversidade conhecida. A criação da BOLD (Barcode of Life Database) facilitou o processo de automação de identificação de espécies e tornou a metodologia acessível a qualquer usuário (RATNASINGHAM; HEBERT, 2007), onde a alimentação do banco de dados é feita pelos próprios grupos de pesquisa. Para que a informação seja acurada e reprodutível, a BOLD listou sete elementos imprescindíveis para a criação dos perfiscoi: nome da espécie válida, dados do voucher (espécime testemunho), instituição onde o voucher está presente, informações sobre o identificador do espécime, sequência COI com no mínimo 500 pares de base (pb), primers utilizados e os eletroferogramas (forward e reverse) (HUBERT; HANNER, 2015). A análise clássica de DNA barcoding é simples e está baseada na distância e similaridade genética entre os pares de sequências, utilizando o modelo de evolução Kimura 2parâmetros (K2P), modelo de substituição livre de parâmetros para transições e transversões, representando a melhor métrica quando as distâncias são baixas (COLLINS et al., 2012), e o algoritmo de NeighborJoining (NJ) (HEBERT et al., 2003). Em geral, indivíduos da mesma espécie possuem uma distância genética (intraespecífica) menor do que quando comparado com indivíduos de outras espécies (distância interespecífica) (HEBERT et al., 2004). Para quantificar essa relação (distância intraespecífica x distância interespecífica),

40 37 a princípio, foi estipulado um valor limite (threshold) de 2% (HEBERT et al., 2003). Isso quer dizer que as espécies identificadas pela metodologia apresentariam distâncias intraespecíficas menores que 2% e distâncias interespecíficas maiores que 2%. Porém, como as espécies apresentam história evolutivas diferentes não seria possível padronizar um threshold para toda a biodiversidade. Então, Hebert et al. (2004) propuseram que para o grupo de estudo, o threshold utilizado para definir o limite de espécie e indicar novas unidades deve ser dez vezes a média intraespecífica. Ao aplicar esse limite em seu estudo, os autores identificaram corretamente 90% das 260 espécies de aves analisadas (média intraespecífica de 0.27%; threshold de 2.7% HEBERT et al., 2004). Além da identificação e descoberta de novas espécies, o DNA barcoding apresenta várias aplicabilidades, ganhando assim vários adeptos a metodologia. Na área de conservação da biodiversidade é capaz de atuar na identificação de ovos, larvas e formas juvenis de espécies ameaçadas obtidas, por exemplo, no comércio ilegal (COSTA; CARVALHO, 2007; ARDURA; LINDE; MOREIRA et al., 2010). Na ecologia, através da identificação da dieta, a partir do conteúdo estomacal ou de fezes, que visa analisar como os hábitos alimentares das diferentes espécies afetam a comunidade (VALENTINI et al., 2009). Na biossegurança, a identificação dos organismos pode ser efetiva no controle de pragas na agricultura, espécies invasoras e monitoramento da água (ARMSTRONG; BALL, 2005). Apesar da metodologia ser empregada com sucesso em vários grupos de animais (pássaros HEBERT et al., 2004; peixes WARD et al., 2005; borboletas JANZEN et al., 2009; répteis NAGY et al., 2012), várias críticas têm sido levantadas. Algumas são metodológicas tais como a escolha do modelo de substituição (COLLINS et al., 2012) e o marcador mitocondrial (problemas quanto a introgressão, presença de pseudogenes, retenção de polimorfismo ancestral) (MORITZ; CICERO, 2004). Enquanto outras são conceituais, como: distinguir indivíduos de espécies que apresentam profunda estrutura filogeográfica (populações isoladas apresentam alta divergência intraespecífica FRÉZL; LEBLOIS, 2008) e se o DNA barcoding está identificando espécies ou entidades moleculares (BLATER et al., 2005). Todas essas críticas são válidas e discutidas por Collins e Cruickshank (2013), que, inclusive, propõem possíveis soluções. Na verdade, definir uma espécie biológica não é uma tarefa fácil e por isso a designação não deve ser baseada em uma única categoria. Ou seja, o DNA barcoding apesar de representar uma poderosa ferramenta para a taxonomia, sem a integração com outras abordagens (Taxonomia Integrativa DAYRAT, 2005), tornase

41 38 simplesmente um identificador de unidades moleculares (FERRI et al., 2009; GALIMBERTI et al., 2012). Diante do exposto acima, o atual estudo propõe analisar a distribuição da variação genética das espécies do gênero Salminus, através da utilização de marcadores moleculares nucleares e mitocondriais, visando inferir sobre relações filogenéticas e padrões filogeográficos do grupo. Assim, estaremos contribuindo para o conhecimento da história evolutiva do gênero. Estas informações ainda poderão servir de subsídios para auxiliar tanto na definição do status taxonômicos das espécies do grupo, que se apresenta bastante confuso, quanto em programas de manejo e conservação, através na identificação de linhagens isoladas historicamente.

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51 48 4. Perguntas e Hipóteses Com base nas lacunas de informações apresentadas na fundamentação teórica para o gênero Salminus três perguntas originaram nosso estudo. Pergunta 1: As divergências morfológicas observadas nas espécies S. hilarii e S. brasiliensis são resultados de linhagens divergentes? A nossa hipótese nula é que as divergências morfológicas observadas nas espécies S. hilarii e S. brasiliensis não são resultados de linhagens divergentes, representando assim polimorfismos intraespecíficos, comuns em espécies com ampla distribuição. Para testar essa hipótese empregaremos a metodologia de DNA barcoding que avaliará se a divergência genética apresentada por S. hilarii e S. brasiliensis é inferior à diversidade genética encontrada entre espécies. Caso seja refutada (hipótese alternativa), Salminus é constituído por mais unidades moleculares e seu status taxonômico precisa ser reavaliado. Pergunta 2: Quais foram os eventos históricos responsáveis pelos processos de diversificações do gênero Salminus? Devido à ampla e disjunta distribuição das espécies de Salminus nas principais bacias hidrográficas sulamericanas, nossa hipótese é que os eventos de vicariância foram os responsáveis pelos processos de diversificação do gênero. Para determinar a sequência de eventos responsáveis pela diversificação das espécies de Salminus nós reconstruímos a filogenia do gênero, com base em marcadores mitocondriais e nucleares, estimamos o tempo de divergência e relacionamos com os eventos geológicos que mudaram a paisagem hidrológica. Pergunta 3: É possível distinguir entre as assinaturas filogeográficas dos eventos de vicariância e geodispersão? Apesar de refletirem distintos padrões biogeográficos, vicariância e geodispersão podem apresentar mesma assinatura filogenética em casos de reestabelecimento de barreiras. Nossa hipótese é que evento de geodispersão apresente como assinatura filogeográfica marcada por um evento fundador. Para testar essa hipótese, empregamos a computação bayesiana aproximada (ABC) para distinguir entre as assinaturas filogeográficas dos eventos e assim testar hipóteses alternativas que influenciaram a história evolutiva de peixes sulamericanos.

52 49 5. Objetivos 5.1 Objetivo geral Avaliar, por meio de filogenia molecular, a sistemática vigente para o gênero Salminus, para examinar as relações evolutivas entre as espécies e inferir sobre os eventos biogeográficos que influenciaram o padrão atual de distribuição geográfica do gênero. 5.2 Objetivo específicos Empregar o DNA barcoding para delimitar as espécies do gênero Salminus; Propor uma filogenia molecular para as espécies do gênero utilizando marcadores moleculares (mitocondrial e nuclear); Analisar os padrões filogeográficos inferidos para Salminus, com a finalidade de compreender a influência dos processos históricos, climáticos e geológicos na distribuição da atual do gênero. Utilizar abordagem bayesiana baseada em modelos para testar hipóteses alternativas e distinguir entre as assinaturas filogeográficas de vicariância e geodispersão na história evolutiva de peixes sulamericanos.

53 50 Capítulo 1 DNA barcoding revela incertezas taxonômicas em Salminus (Characiformes) (Aceito na revista Systematics and Biodiversity) Machado, C.B., Ishizuka, T.K., Freitas, P.D., Valiati, V.H. & Galetti Jr., P.M. DNA barcoding reveals taxonomic uncertainty in Salminus (Characidae). Systematics and Biodiversity, no prelo.

54 51 DNA barcoding revela incertezas taxonômicas em Salminus (Characiformes) Carolina de Barros Machado da Silva 1*, Tamylin Kaori Ishizuka 1, Patrícia Domingues de Freitas 1, Victor Hugo Valiati 2 & Pedro Manoel Galetti Jr 1. 1 Departamento de Genética e Evolução, Universidade Federal de São Carlos, Rodovia Washington Luís, Km 235 SP310, São Carlos, SP, ,. Phone: Laboratório de Biologia Molecular, Universidade do Vale do Rio dos Sinos, Avenida Unisinos, 950, São Leopoldo, RS, ,. Phone: s: Título curto: Revelando incertezas taxonômicas em Salminus *Autor para correspondência

55 52 Resumo Salminus é um gênero constituído por quatro espécies de peixes migratórios e predadores topo de cadeia alimentar. Embora seja um grupo com grande importância econômica e ecológica, sua taxonomia não está completamente esclarecida. O objetivo deste estudo foi detectar se os problemas taxonômicos previamente verificados são consequências de linhagens divergentes dentro das espécies. Em caso afirmativo, nós queremos saber se essas divergências são suficientes para sinalizar táxons potencialmente não descritos. Para isso, nós empregamos as análises tradicionais do DNA barcoding e GMYC (generalized mixed Yulecoalescent) baseadas no gene COI e reconstrução de Inferência Bayesiana (IB) para o marcador nuclear RAG2 em todas as espécies de Salminus atualmente reconhecidas, com uma amostragem distribuída por diferentes bacias hidrográficas. Oito MOTUs (Molecular Operation Taxonomic Units) foram determinadas por ambas metodologias, e recuperadas nas análises topográficas do gene COI com NeighborJoining (NJ) e IB. Apenas S. affinis e S. franciscanus formaram haplogrupos monofiléticos. S. brasiliensis e S. hilarii apresentam, respectivamente, duas e quatro linhagens mitocondriais distintas e distâncias intraespecíficas, baseada em K2P (Kimura 2Parâmetros), maiores que o ótimo threshold (OT) estimado (1.1%). A árvore do gene nuclear RAG2 suportou apenas duas linhagens de S. hilarii, mas nenhuma do S. brasiliensis. Todas essas linhagens mitocondriais, para ambas as espécies, apresentam correspondência com os polimorfismos morfológicos descritos em estudos prévios. Nós sugerimos um novo cenário taxonômico constituído por seis espécies (S. affinis, S. franciscanus, S. brasiliensis, S. hilarii, S. sp. Amazonas e S. sp. Araguaia) e a necessidade desse novo conhecimento ser considerado nas políticas de conservação no território brasileiro para Salminus. Palavras chaves: Análise GMYC, espéciescrípticas, marcador nuclear, MOTU, peixes neotropicais de água doce, polimorfismo morfológico.

56 53 Introdução A ictiofauna Neotropical de água doce é umas das mais diversas do mundo. Estimativas atuais indicam que essa diversidade pode ser ainda maior, uma vez que cerca de 3040% dos peixes ainda não foram descritos (de Carvalho et al., 2011), principalmente devido à presença de espécies crípticas (Albert & Reis, 2011; Reis, Kullander, & Ferraris Jr., 2003). Para acelerar a descoberta de espécies, o DNA barcoding que emprega um sistema de bioidentificação animal global através do uso de um marcador mitocondrial Citocromo C Oxidase I (COI; Hebert, Cywinska, Ball, & DeWaard, 2003) tem sido proposto como uma estratégia viável e eficiente para ajudar revisões taxonômicas em peixes Neotropicais (Bellafronte, Mariguela, Pereira, Oliveira, & MoreiraFilho, 2013; CostaSilva, Rodriguez, Roxo, Foresti, & Oliveira, 2015; de Carvalho et al., 2011; Pereira, Hanner, Foresti, & Oliveira, 2013; Pereira, Maia, Hanner, Foresti, & Oliveira, 2011; Rosso, Mabragaña, González Castro, & Díaz de Astarloa, 2012). Embora empregado com sucesso em protocolos de identificação e delimitação de vários grupos de animais (aves, Hebert, Stoeckle, Zemlak, & Francis, 2004; borboletas, Janzen et al., 2009; répteis, Nagy, Sonet, Glaw, & Vences, 2012; peixes, Ward, Zemlak, Innes, Last, & Hebert, 2005), atualmente, a metodologia é frequentemente utilizada como um componente de abordagens integrativas para a delimitação de espécies (Dayrat, 2005), juntamente com o uso de marcadores nucleares. O gênero Salminus tem sido identificado como um dos grupos de peixes Neotropicais que pode vir a ser beneficiado com a abordagem de DNA barcoding. Considerado um gênero monofilético da família Bryconidae (Oliveira et al., 2011), é constituído por peixes migratórios de médio e grande porte apreciados na pesca comercial e esportiva (Lima & Britski, 2007). As espécies de Salminus estão distribuídas por todas as principais bacias hidrográficas sulamericanas, ocorrendo em rios de primeira e segunda ordem. Os adultos são

57 54 predadores topo de cadeia apresentando um papel chave na dinâmica, funcionamento e estrutura dos ecossistemas de água doce. Apesar de sua importância ecológica e comercial, a taxonomia de Salminus é ainda pobremente resolvida (Lima & Britski, 2007). Atualmente, quatro espécies são reconhecidas em Salminus (Lima & Britski, 2007; Lima et al., 2003): (i) Salminus affinis (Steindachner, 1880), restrita às bacias do rio Magdalena, Ranchería e Sinú, na Colômbia; (ii) Salminus brasiliensis (Cuvier, 1816), encontrada por toda bacia Platina (composta pelas bacias do Paraná, Paraguai e Uruguai) na Argentina, no Paraguai, Uruguai e, bacia do Iguaçu e drenagem de Lagoa dos Patos no ; (iii) Salminus franciscanus (Lima & Britski, 2007), endêmica da bacia do São Francisco, ; e (iv) Salminus hilarii (Valenciennes, 1850), distribuída nas bacias do Alto rio Paraná, São Francisco e TocantinsAraguaia no, e nas bacias do Alto Amazonas e Orinoco no, Colômbia, Equador, Peru e Venezuela (Fig. 1). Caracteres morfológicos têm sido tradicionalmente empregados para delimitar as espécies de Salminus. No entanto, a necessidade de empregar ferramentas adicionais para a identificação das espécies tornouse evidente nos últimos anos. Variação intraespecífica em caracteres morfológicos empregados como diagnósticos, por exemplo, têm sido observados em S. brasiliensis e S. hilarii (Rosso et al., 2012; Shibatta & Garavello, 1993, respectivamente). Para S. hilarii, as diferenças morfológicas observadas ocorrem entre as bacias hidrográficas (Lima, 2006): espécimes das bacias hidrográficas do TocantinsAraguaia, Alto Amazonas e Orinoco são diferentes daqueles encontrados no Alto rio Paraná e São Francisco. Essa diferença fenotípica é considerada pelo autor como suficiente para se dar um novo tratamento taxonômico aos dois grupos: ambos devem ser elevados ao nível de espécie. Shibatta e Garavello (1993), analisando apenas espécimes da bacia do Alto rio Paraná e rio São Francisco, também identificaram variação morfológica significativa entre espécimes de cada bacia hidrográfica, sugerindo a necessidade de mudanças taxonômicas para a espécie.

58 55 Diante dessas variações morfológicas entre bacias, é necessário identificar se dados moleculares igualmente suportam a existência de múltiplas linhagens evoluindo independentemente dentro do que atualmente é reconhecido como S. hilarii. Polimorfismo morfológico também foi documentado para S. brasiliensis, que apresenta uma delimitação de espécie controversa. A lista de espécies de peixes de água doce da América do Sul (Lima et al., 2003), não suporta a presença de múltiplas linhagens dentro de S. brasiliensis e sinonimizou todos os nomes disponíveis na literatura. Entretanto, Rosso et al. (2012), utilizando dados merísticos e caracteres morfológicos, juntamente com dados moleculares (DNAmit), sugeriram que alguns espécimes coletados na Planície dos Pampas (Argentina) constituíam uma distinta espécie de Salminus. Diante da complexa taxonomia do gênero, nós empregamos a análise tradicional de DNA barcoding e uma moderna abordagem quantitativa de delimitação de espécies (GMYC), juntamente com análises para um marcador nuclear (RAG2 Recombination Activating Gene 2) para contribuir com a sistemática do grupo. Nós especificamente perguntamos se as diferenças morfológicas observadas em S. hilarii e S. brasiliensis correspondem a linhagens divergentes, e, se sim, se a quantidade de divergência genética observada é similar ao que é detectado entre as espécies nominais. Nós usaremos esses resultados para sinalizar potenciais táxons não descritos e para preencher lacunas de conhecimento que necessitem de atenção. Material e Métodos Material amostrado Um total de 111 espécimes, representando as quatro espécies nominais e dois espécimes do gênero Brycon (grupo externo mais estreitamente relacionado a Salminus (Ortí e Meyer, 1997), foram coletados em distintas bacias hidrográficas da América do Sul, ou obtidos de

59 56 pesquisadores colaboradores (Tabela 1, Fig. 1). Amostras biológicas consistiram de fragmentos da nadadeira peitoral e apenas 23 vouchers, representando as espécies encontradas em diferentes regiões, foram depositados em coleções ictiológicas. Os demais espécimes foram devolvidos ao rio depois da coleta do tecido. A opção de devolução do animal ao habitat se deve ao atual status de conservação do gênero (redução acentuada dos estoques naturais devido às ações antrópicas). As informações dos espécimes estão publicamente disponíveis através no Barcode of Life Data System (BOLD), projeto DNA barcoding de Salminus (Characiformes), código PBS. Extração de DNA, amplificação, purificação e sequenciamento Nós extraímos o DNA genômico a partir do fragmento da nadadeira peitoral através da utilização do protocolo de precipitação salina, proposto por Aljanabi & Martinez (1997). Posteriormente, 700 pb (pares de base) foram amplificados da região 5 do gene COI utilizando os primers FishF1 e FishR1 (Ward et al., 2005). As reações de PCR ocorreram em um volume final de 25 μl contendo 16,9 μl de água miliq, 2,5 μl tampão 10 de PCR Invitrogen (1), 2,5 μl dntps (0,25 mm), 1 μl MgCl2 (2 mm), 0,5 μl de cada primer (0,2 μm), 0,1 μl Platinum Taq polimerase (0,5 unidade) e 1μL DNA (50ng/μL). As condições para amplificação do gene foi uma desnaturação inicial a 94 o C por 2 min, seguido de 35 ciclos de 30s a 94ºC, 45s a 52ºC, 1 min a 72ºC; finalizando a temperatura de extensão de 72ºC por 10 min. Para amplificar 1000 pb do marcador nuclear RAG2, nós usamos os primers, reações e condições de reação da cadeia da polimerase (PCR) descritas por Oliveira et al. (2011). Todas as reações de PCR foram realizadas em termociclador Veriti 96Well Thermal Cycler (Applied Biosystems). Após a verificação da amplificação em gel de agarose a 1%, todos os produtos de PCR foram purificados utilizando o protocolo de polietilenoglicol 20% (Kusukawa et al., 1990). Os fragmentos foram sequenciados em sequenciador automático

60 57 ABI3730L, Applied Biosystems. As sequências e eletroferogramas (trace files) foram também depositados na BOLD. As sequências (COI e RAG2) estão também disponíveis GenBank (ver Tabela S1 para os números de acesso). Análise de dados Nós alinhamos e editamos todas as sequências obtidas utilizando o software Geneious R7 v6.1.6 (Kearse et al., 2012) e as combinamos com sequências COI de referência das espécies S. brasiliensis, S. franciscanus e S. hilarii que já estão disponíveis no banco de dados da BOLD (as sequências referências recebem a identificação dos projetos a qual fazem parte, FARGB, FUPR e BSB, juntamente com uma numeração). Essas sequências de referência são consideradas perfis barcode, ou seja, seu status taxonômico já foi previamente confirmado através de análises morfológicas. O critério para a delimitação de espécies através do DNA barcoding utiliza as informações de monofilia (baseado no método de construção topológica) e divergência genética. Em geral, os táxons definidos pela metodologia são congruentes com as espécies biológicas e apresentam baixa divergência intraespecífica e altas divergências interespecíficas (a diferença entre essas distâncias criaria uma lacuna, denominada de Barcoding gap) quando comparadas com o threshold adotado (Hebert et al., 2004). Para determinar o ponto de corte, nós evitamos o emprego de um valor padronizado, como o threshold de 2% adotado para a identificação dos peixes Neotropicais (Pereira et al., 2013), pois os táxons apresentam taxas mutacionais variáveis e diferentes histórias de vida. Nós, então, calculamos o valor, denominado de ótimo threshold (OT), de divergência molecular diretamente do nosso conjunto de dados, utilizando a função localminima, um método experimental implementado no pacote SPIDER (SPecies IDentity and Evolution in R; Brown et al., 2012) para a plataforma R ( Essa função é baseada no conceito de

61 58 barcoding gap (Meyer & Paulay, 2005). O gráfico de densidade das distâncias genéticas gerado apresentará uma depressão que representa o ponto onde ocorre a transição entre as distâncias intra e interespecíficas. A vantagem deste método é não necessitar de conhecimento a priori sobre a identidade das espécies para determinar o OT (Brown et al., 2012). Após estabelecer o OT, nós utilizamos o seu valor para obter as unidades taxonômicas operacionais moleculares no software jmotu (Jones et al., 2011) (MOTUs, em inglês, molecular operational taxonomic unit; Blaxter et al., 2005; Galimberti et al., 2012). As MOTUs são agrupamentos de sequências que agem como representantes genômicos das entidades moleculares. Portanto, elas não representam as espécies, mas unidades moleculares, conceito comumente abordado no DNA barcoding (Casiraghi, Labra, Ferri, Galimberti, & de Mattia, 2010). Nós usamos o Mega 6 (Tamura et al., 2013) para calcular as médias das distâncias genéticas intra e interespecífica, baseada no modelo de evolução Kimura 2paramêtros (K2P) (Kimura, 1980). Uma topologia de NeighbourJoining (NJ) (Saitou & Nei, 1987) foi construída sob esse mesmo modelo com o objetivo de representar graficamente as divergências entre as espécies. O suporte dos clados foram avaliados por Bootstrap (1000 pseudoréplicas), conforme Felsentein (1985). Todas as análises descritas acima são padrões nos estudos empregando DNA barcoding. Devido às críticas em relação ao uso do K2P como modelo de substituição (Meyer & Paulay, 2005), nós também utilizamos a distância p, como proposto por Collins, Boykin, Cruickshank e Armstrong (2012), e o melhor modelo indicado pelo software jmodeltest 3.7 (K80+G; Posada, 2008). Diferenças entre os três modelos foram mínimas e estavam relacionadas a quantidade de divergência genética estimada e a configuração da topologia da árvore. Por esta razão, nós apenas mostraremos os resultados baseados no emprego do modelo de K2P.

62 59 Além da tradicional abordagem baseada em distância para delimitar os grupos de DNA mitocondrial (DNAmit), nós também utilizamos uma abordagem filogenética usando GMYC (General mixed Yule Coalescent). Este método explora, a partir de uma árvore ultramétrica, a diferença prevista nas taxas de ramificação entre os eventos de especiação e extinção (relações interespecíficas) e os eventos de coalescência (relações intraespecíficas), com base no comprimento dos ramos. Assim, o método detecta mudanças nos comprimentos dos ramos que estariam associados à transição entre especiação/extinção e coalescência, e consequentemente, aos limites específicos (Pons et al., 2006). A análise de GMYC necessita de uma árvore ultramétrica, que foi determinada usando o BEAST v (Bouckaert et al., 2014) sob as seguintes condições: modelo de substituição calculado no Partition Finder (será discutido a seguir), relógio molecular relaxado com uma distribuição de lognormal e o modelo de especiação birthdeath, conforme sugerido por CostaSilva et al. (2015). O modelo de GMYC foi conduzido no pacote SPLITs (SPecies LImits by Threshold Statistics; Monaghan et al., 2009) do R utilizando o método de threshold único, ou seja, detecta um único ponto de transição entre os processos de especiação/extinção e coalescência, e parâmetro de intervalo padrão (intervalo = c(1,10)). Devido ao fato do GMYC ser baseado em uma função de verossimilhança que está diretamente relacionada com processos evolutivos, o método proporciona um avanço no processo de delimitação de espécies baseado em dados moleculares. Para testar se as conclusões fornecidas pela a aplicação do DNA barcoding e GMYC, ambos baseados no gene COI, são replicadas quando marcadores adicionais (independentes) são empregados, nós realizamos a reconstrução da topologia do gene nuclear RAG2 através da abordagem de Inferência Bayesiana. Para isso, nós sequenciamos dois indivíduos de cada MOTU, identificada previamente pelas análises do DNAmit. Antes de proceder com as análises filogenéticas, nós checamos possíveis eventos de recombinação com RDP3.44

63 60 (Martin & Rybicki, 2000). Nós também avaliamos a saturação das substituições para ambos marcadores (COI e RAG2) através do Índice de saturação de substituição (Iss) baseado em entropia, estimado no DAMBE (ia, ie, Salemi, Chen, & Wang, 2003). Essa avaliação certifica se o nosso conjunto de dados é apropriado para reconstruções filogenéticas. Modelos de evolução e o melhor esquema de partição, incluindo partições por códon, foram determinadas no Partition Finder usando o critério de informação bayesiana (Lanfear, Calcott, Ho, & Guindon, 2012). Todas as análises bayesianas foram realizadas no BEAST v Quatro cadeias independentes de Markov foram iniciadas a partir de árvores aleatórias e corridas com 10 milhões de gerações, com parâmetros e árvores sendo salvas a cada 1000 gerações. Para o burnin foram descartadas 25% das topologias, e os arquivos de log e tree foram combinados utilizando LogCombiner v (Drummond, Suchard, ie, & Rambaut, 2012). A mixagem apropriada dos dados foi verificada com o Tracer v1.5 (Rambaut & Drummond, 2007), e o tamanho efetivo da amostragem (ESS, em inglês, effective sample size) de 200 ou mais foi necessário para todos os parâmetros. Resultados Depois do alinhamento e da edição das sequências, a média do comprimento dos 137 fragmentos do gene COI (111 sequências obtidas no presente estudo e 26 sequências do banco de dados da BOLD) foi 616 pb (variação de ). Do total dos 647 pb analisados, 128 sítios foram polimórficos. A maioria dos sítios polimórficos ocorreram na terceira posição dos códons (88.64%, 117 sítios) não alterando o aminoácido produzido; apenas 11 mutações foram não sinônimas: duas mudanças na primeira posição do códon, uma na segunda e as demais mutações na terceira posição do códon. Nenhuma inserção, deleção ou stop códon foi

64 61 observado, suportando a hipótese de que todos os fragmentos são sequências funcionais do gene COI e não NUMTs (pseudogenes mitocondriais nucleares). A função LocalMinima no SPIDER propôs um OT de (ou 1.1%) como o valor que acarreta na possível transição entre as distâncias intra e interespecíficas. Este valor não apresentou erros acumulativos (a soma entre falsos positivos e falsos negativos), calculados a partir da função threshval do mesmo pacote. Duas espécies de Salminus apresentaram distâncias intraespecíficas maiores que o OT: S. brasiliensis (máxima de 8%, média de 3.6%) e S. hilarii (máxima de 11.1%, média de 5%, Tabela S2). Oito MOTUs foram identificadas usando o OT como o ponto de corte barcode no jmotu. Singletons (MOTUS representadas por uma única sequência) não foram identificados. Apenas os espécimes de S. affinis e S. franciscanus representaram uma MOTU cada. Quatro e duas MOTUS correspondem as espécies válidas S. hilarii e S. brasiliensis, respectivamente. Comparando os resultados das MOTUs com os haplogrupos obtidos pela árvore de NJ (Fig. 2.1), nós identificamos uma estreita relação entre eles. A topologia de NJ agrupou todas as sequências dentro de oito grandes haplogrupos fortemente suportados; apenas duas dessas linhagens monofiléticas correspondem as espécies atualmente reconhecidas: o haplogrupo 3 incluiu todos os indivíduos associados com a espécie nominal S. affinis, enquanto o haplogrupo 5 incluiu indivíduos reconhecidos como S. franciscanus. Os nomes S. brasiliensis e S. hilarii são atualmente utilizados para identificar pelo menos duas distintas linhagens mitocondriais estruturadas geograficamente que não formam grupos monofiléticos. Os haplótipos COI de S. hilarii estão divididos em quatro haplogrupos (1, 2, 7, 8), constituídos de espécimes da bacia amazônica (passará a ser denominado de S. sp. Amazonas, uma vez que o marcador nuclear também suporta que é uma unidade distinta daquela conhecida como S. hilarii), bacia do TocantinsAraguaia (denominado S. sp. Araguaia, pelo mesmo motivo discutido anteriormente), bacia do São Francisco (S. hilarii 1), e bacias do Alto rio Paraná e

65 62 São Francisco (S. hilarii 2), respectivamente. Haplótipos de S. brasiliensis foram estruturados em dois haplogrupos: o haplogrupo 4 apresenta espécies provenientes das bacias do Uruguai e Paraguai e drenagem da Lagoa dos Patos (S. brasiliensis 1), e o haplogrupo 6 foi formado por peixes do Alto rio Paraná e 3 espécimes da bacia do Uruguai (S. brasiliensis 2). Considerando os oito haplogrupos como as MOTUs, as médias das distâncias dentro de cada MOTU (intramotu) foi menor que o OT. As médias das distâncias genéticas entre MOTUs (intermotu) foram acima do 1.1%, mesmo quando as duas linhagens atualmente chamadas de S. brasiliensis (S. brasiliensis 1 e S. brasiliensis 2) e as quatro MOTUs atualmente associadas com o nome S. hilarii foram comparadas entre si. A distância inter MOTU mais próxima do OT foi observada entre S. hilarii 1 e S. hilarii 2 (1.7%, Tabela 2). Nós comparamos as máximas distâncias intraespecíficas e mínimas distâncias interespecíficas para cada espécie nominalmente reconhecida (Fig. 3) através da aplicação do threshold do DNA barcoding. Esta abordagem distribui as unidades taxonômicas em quatro quadrantes (Fig. 3). O quadrante I incluiu S. affinis e S. franciscanus, ambos apresentando distâncias intraespecíficas mais baixas que 1.1% e distâncias interespecíficas maiores que 1.1%. O quadrante II, frequentemente utilizado para sinalizar a potencial existência de espécies crípticas (Hebert et al., 2004), incluiu S. brasiliensis e S. hilarii, como reconhecidas atualmente, com distâncias intra e interespecíficas maiores que 1.1%. Nenhum grupo caiu nos quadrantes III e IV. O quadrante III é empregado para identificar casos de sinonímia, divergência recente e hibridizações (distâncias intra e interespecíficas <1.1%). O quadrante IV sinaliza casos de ausência de correspondência entre taxonomia e identificação baseada em DNAmit (distância intraespecífica >1.1% e distância interespecífica <1.1%) (Hebert et al., 2004). Quando as oito MOTUS são consideradas, o quadrante I abriga todas elas (dados não apresentados).

66 63 Nenhum sinal de saturação foi observado entre os marcadores (COI Iss= 0.118, Issc=0.804 para árvore simétrica, para árvore não simétrica, p < 0.000; RAG2 Iss=0.015, Issc =0.759 para árvore simétrica, para árvore não simétrica, p < 0.000). O modelo mais apropriado para a substituição de nucleotídeos, o qual foi particionado para cada marcador por códon, está na Tabela S3. Nós não detectamos evidências de recombinação para o RAG2. Considerando Brycon sp. como o grupo externo, a máxima verossimilhança para o modelo de GMYC foi significativamente superior (L = ) à verossimilhança do modelo nulo (L0 = , pvalue 0.000). O único ponto de transição entre os processos de coalescência e especiação/ extinção, linha cinza vertical na Fig. 2.2, das análises de GMYC sugerem a presença de nove ML entidades (consideradas espécies para a análise) com um intervalo de confiança de 710. O GMYC recuperou os mesmos oito grandes haplogrupos identificados pela análise de NJ (Fig. 2.2). A nona entidade molecular foi constituída pelos espécimes de Brycon sp. Nesta análise bayesiana, S. sp. Amazonas recuperou aparentemente uma estruturação entre o rio Madeira (SI_015, SI_016 e SI_017) e os rios Amazonas e Orteguaza (SI_019, SI_020, SI_024 e SI_026) (Fig. 2.2). A topologia bayesiana no marcador nuclear, recuperou cinco clados com alta probabilidades posteriores, dos quais quatro corresponderam às MOTUs identificadas na árvore do gene COI: S. affinis (clado 1), S. sp. Araguaia (clado 2), S. sp. Amazonas (clado 3), S. franciscanus (clado 4) e um clado (5) constituído por espécimes S. brasiliensis 1, S. brasiliensis 2, S. hilarii 1 e S. hilarii 2 (Fig. 4). Neste último grupo, as relações entre essas MOTUs foram fracamente suportadas, com probabilidades posteriores inferiores a 40%.

67 64 Discussão As MOTUs nem sempre correspondem às espécies (conceito biológico Coyne & Orr, 2004), porém a identificação das unidades taxonômicas moleculares é uma abordagem preliminar poderosa no DNA barcoding porque não é afetada pela nomenclatura vigente, servindo como um ponto de partida para auxiliar nas abordagens de delimitação de espécies (Blaxter et al., 2005). Por esta razão, de acordo com o DNA barcoding, Salminus não deve ser composto por apenas quatro espécies nominais atualmente válidas. As oito MOTUs estimadas por diferentes métodos (jmotu e GMYC) e observadas nas topologias de NJ e IB (Fig. 2), associada a informação das altas distâncias intraespecíficas em S. brasiliensis e S. hilarii, são evidências de que existem outras unidades taxonômicas dentro do gênero. Enquanto S. affinis e S. franciscanus foram aqui recuperadas como entidades moleculares bem definidas e espécies sem incoerência taxonômica, para S. brasiliensis e S. hilarii, os polimorfismos morfológicos entre bacias hidrográficas descritos em estudos prévios (Lima, 2006; Rosso et al., 2012) podem estar relacionados com as linhagens genéticas divergentes do presente estudo. No geral, a aplicação do DNA barcoding sugere um novo cenário para as espécies que constituem o gênero Salminus. S. affinis e S. franciscanus não necessitam passar por revisões; S. brasiliensis deveria ser o nome utilizado para espécimes originados das bacias do Baixo rio Paraná, Paraguai e Uruguai (aqui denominados de S. brasiliensis 1); S. hilarii deveria ser usado como o nome válido dos espécimes da bacia do São Francisco (aqui nomeados de S. hilarii 1). Finalmente, o DNA barcoding suporta quatro espécies candidatas: S. sp. Amazonas, S. sp. Araguaia, S. hilarii 2 e S. brasiliensis 2. A análise utilizando o marcador RAG2 suporta apenas S. sp. Amazonas e S. sp. Araguaia como potenciais novas unidades biológicas, mas não S. hilarii 2 e S. brasiliensis 2 (Fig. 4). Para essas duas últimas, nós

68 seremos cautelosos em definir o real status taxonômico e sugeriremos mais investigações para testar a provável presença de espécies não reconhecidas. 65 Diversidade críptica em S. brasiliensis Indivíduos atualmente reconhecidos como S. brasiliensis têm sido reportados na literatura como Salminus maxillosus, Salminus cuvieri e Salminus orbignyanus, inclusive como integrante de outros gêneros (Hydrocynus brasiliensis, Hydrocyon brevidens, Salmo 27 radiatus e Salmo auratus) (Lima et al., 2003). Apesar desta complexa nomenclatura, Géry e Lauzanne (1990) sinonimizou todos os nomes e reconheceu S. brasiliensis como uma única unidade biológica. Entretanto, nossas análises barcoding revelaram duas MOTUs bem definidas dentro da espécie nominal S. brasiliensis, que apresentam 7.2% de divergência entre essas duas linhagens, aproximadamente sete vezes maior que o OT (1.1%). Rosso et al. (2012), avaliando a eficiência do DNA barcoding para a ictiofauna da Planície dos Pampas, na Argentina, também identificou uma profunda divergência entre duas linhagens de S. brasiliensis. Alguns desses espécimes foram utilizadas em nossas análises (sequências FARGB na Fig. 2). Uma dessas linhagens agrupou com espécimes do Paraguai e Uruguai e formaram S. brasiliensis 1. A outra linhagem divergente, constituída por um único haplótipo (FARGB315), agrupou com espécimes do Alto rio Paraná e duas do rio Uruguai e formaram S. brasiliensis 2. Como a localização do holótipo de S. brasiliensis foi descrita para a região do Pantanal, bacia do rio Paraguai (Géry & Lauzanne, 1990), S. brasiliensis 1 representa a espécie nominal S. brasiliensis, enquanto S. brasiliensis 2, constituída por espécimes do Alto rio Paraná e 3 espécimes do rio Uruguai, necessita ser avaliada quanto aos seu status taxonômico, ou seja, se essa unidade representa uma linhagem diferente de S. brasiliensis ou se é uma nova espécie.

69 66 A análise com um marcador nuclear (RAG2) falhou em reconhecer os haplogrupos de S. brasiliensis como linhagens independentes. Devido às baixas taxas de substituição do RAG2 em relação ao COI, as relações entre S. brasiliensis (1 e 2) e S. hilarii (1 e 2) não foram esclarecidas (Fig. 4). Portanto, a parafilia de S. brasiliensis é suportada apenas se assumirmos que a topologia do COI reflete a verdadeira história da espécie. Baseado na análise DNA barcoding, nós sugerimos uma revisão abrangente dos espécimes do Alto rio Paraná e suas relações com espécimes de S. brasiliensis da localidade tipo e demais regiões. Embora a amostragem do presente estudo indique que os haplogrupos estão segregados por bacias hidrográficas, estudos futuros podem encontrar múltiplas linhagens em uma mesma localidade (conforme encontrado no haplogrupo 6). Durante a construção da usina hidrelétrica de Itaipu (e consequente afogamento das Cataratas de Sete Queda), uma extensão de 150 Km do rio, pertencente ao Baixo rio Paraná, foi incorporada ao Alto rio Paraná. Esta ação, associada a implementação de um rio artificial (canal de piracema), que conecta o reservatório de Itaipu a porção a jusante da usina, permitindo o fluxo da fauna, potencialmente facilitou o contato entre linhagens mitocondriais isoladas desde a formação das Cataratas de Sete Quedas (Prioli et al., 2012). Diversidade críptica em S. hilarii Ambos marcadores (mitocondrial e nuclear) revelaram que espécimes de S. hilarii do Alto rio Paraná e São Francisco (localidade tipo) tem evoluído independentemente dos espécimes das bacias do Amazonas e TocantinsAraguaia (Figs. 2, 4). Este dado corrobora prévias análises morfológicas (Lima, 2006) e moleculares (Abe et al., 2014). A novidade das nossas análises é a descoberta de que espécimes do Amazonas e TocantinsAraguaia são também distintos entre si, tanto com marcador mitocondrial quanto o nuclear (S. sp. Amazonas e S. sp. Araguaia, respectivamente). A média da distância genética

70 67 entre esses dois grupos foi de 8.5%, valor considerado suficiente para serem considerados distintas entidades biológicas, considerando nossas análises de DNA barcoding. Embora variações morfológicas nos espécimes do Amazonas e TocantinsAraguaia tenham sido consideradas apenas em nível intraespecífico (Lima, 2006), nossa proposta, baseada nas análises moleculares de delimitação de espécie e no marcador nuclear, é que ambas MOTUs sejam elevadas ao nível de espécie. Outro problema taxonômico que nós investigamos está relacionado aos espécimes das bacias do Alto rio Paraná e São Francisco. Shibatta & Garavello (1993), baseado em análise de componentes principais de dados morfométricos, sugeriram que ambas as bacias apresentam distintas unidades taxonômicas. DNA barcoding também suportou duas linhagens bem definidas, porém esta não é coincidente com as bacias hidrográficas: S. hilarii 1 (constituída apenas por espécimes da bacia do São Francisco) e S. hilarii 2 (composta por espécimes tanto do Alto rio Paraná quanto do São Francisco). A divergência intermotu entre elas foi de 1.7%, valor próximo ao OT (Tabela 2). É impossível determinar qual MOTU representa a espécie S. hilarii, uma vez que o holótipo é da bacia do rio São Francisco e ambas MOTUs apresentam espécimes dessa bacia (Fig. 2). Mesmo não existindo estruturação em bacias hidrográficas dessas MOTUs, nós hipotetizamos que essas linhagens poderiam ter evoluído separadamente em cada bacia e experimentaram um contato secundário, um vez que não existe compartilhamento de haplótipos entre as bacias do rio Alto Paraná e o rio São Francisco, na MOTU S. hilarii 2. Esse contato secundário pode ter derivado de capturas de cabeceira históricas (Buckup, 2011) ou ter sido promovido pela ação antrópica, como a transposição do sistema hidrográfico do Piumhi que corria para a bacia do Paraná e teve o seu curso mudado, passando a fazer parte da bacia do São Francisco (MoreiraFilho & Buckup, 2005). Esses eventos poderiam explicar o porquê de alguns espécimes do São Francisco agruparem com indivíduos do Alto Paraná e

71 68 também concordariam com os resultados de Shibatta e Garavello (1993). Se consideramos esta explicação, S. hilarii 1 seria a MOTU que representaria a espécie S. hilarii. De qualquer forma, uma análise morfológica detalhada, incluindo o holótipo, e estudos filogeográficos para avaliar o real status taxonômico dessas MOTUs ainda é necessário. Conclusões e Aplicação O atual estudo suporta que o DNA barcoding (baseado em distância e em modelos, GMYC) é uma adequada ferramenta para revelar incertezas taxonômicas dentro de espécies de peixes. Esta metodologia, associada à análise com gene nuclear, mostrou a existência de, no mínimo, duas novas candidatas a espécies no gênero Salminus, representadas aqui como S. sp. Amazonas e S. sp. Araguaia. Diante dessa conclusão, o gênero passaria a ser constituído por seis espécies. S. brasiliensis 2 e S. hilarii 2 foram suportadas apenas pelo marcador mitocondrial. Para essas unidades moleculares, nós encorajamos novos estudos, utilizando outro marcador nuclear mais elucidativo para melhor definir seus status taxonômicos. Além da taxonomia, outro impacto dos nossos resultados está na implementação de políticas conservacionistas para o gênero Salminus. Todas as espécies estão passando por um severo declínio populacional em consequência da pesca predatória, introdução de espécies exóticas e, principalmente, fragmentação de habitat. Apesar desse cenário alarmante, nenhuma das espécies válidas de Salminus, presente em território brasileiro, está incluída em listas de espécies ameaçadas internacional (IUCN, 2014) ou nacional (IBAMA, 2014). A falta de clareza na delimitação das espécies provavelmente conduziu suas ausências nessas listas. De acordo com Rosa e Lima (2008), S. brasiliensis não foi incluído na lista vermelha brasileira porque algumas populações da bacia do Paraguai estão presentes na região do Pantanal, ecossistema relativamente intacto e protegido por políticas de conservação. Por esta

72 69 razão, S. brasiliensis não pode ser considerado uma espécie ameaçada. Entretanto, nossos dados se opõem a essa justificativa, pois esta espécie está constituída de distintos haplogrupos. Na biologia da conservação e na aplicação de leis ambientais, o haplogrupo do Alto rio Paraná representa, pelo menos, uma unidade evolutiva significativa (UES), população pertencente a uma mesma espécie, porém diferente geneticamente de outras populações (em nosso caso, é um haplogrupo distinto do rio Paraguai), e contribui com a diversidade genética encontrada na espécie como um todo (Hey, Waples, Arnold, Butlin, & Harrison, 2003). Em síntese, nosso estudo foi capaz de identificar uma diversidade oculta nas espécies atualmente válidas para o gênero e, pelo menos duas novas espécies aguardam descrição, totalizando seis espécies no gênero Salminus: S. affinis, S. franciscanus, S. brasiliensis, S. hilarii, S. sp. Amazonas e S. sp. Araguaia. Futuros estudos taxonômicos, integrando as informações morfológicas e moleculares são necessários para a descrição dessas novas espécies, bem como para esclarecer mais profundamente a diversidade também presente em S. brasiliensis e S. hilarii. Agradecimentos Nós somos gratos ao Dr. Mauricio Carrillo Avila, da Universidad Surcolombiana; Dr. Hernan Ortega, do Museo de Historia Natural, Universidad Nacional Mayor de San Marcos; Dra. Carolina Rodrigues da Costa Doria, Laboratório de Ictiologia e Pesca, Universidade Federal de Rondônia pelas doações de tecidos e ao Dr. Flávio Lima por nos ajudar com valiosas informações taxonômicas. Um agradecimento especial ao Dr. Jorge Ramirez pela coleta em campo das amostras. Estamos em débito com a Dra. Ana Carolina Carnaval e Maria Strangas, ambas da City University of New York, pela edição do idioma e revisão do manuscrito. Esta

73 70 pesquisa foi subsidiada pelo BrBOL (Brazilian Barcode of Life), CAPES (Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior), FAPESP (Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo) e CNPq (Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico).

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80 77 análise morfométrica multivariada em componentes principais. Naturalia, 18, Tamura, K., Stecher, G., Peterson, Filipski, A., & Kumar, S. (2013). MEGA6: Molecular Evolutionary Genetics Analysis version 6.0. Molecular Biology and Evolution, 30, ia,., ie, Z., Salemi, M., Chen, L., & Wang, Y. (2003). An index of substitution saturation and its application. Molecular Phylogenetics and Evolution, 26, 17. Ward, R. D., Zemlak, T. S., Innes, B. H., Last, P. T., & Hebert, P. D. N. (2005). DNA barcoding Australia's fish species. Philosophical Transactions of the Royal Society of London Series B, Biological Sciences, 360,

81 78 TABELAS E FIGURAS Tabela 1. Área de distribuição e locais de coleta de Salminus na América do Sul. Espécie/ Espécimes Localidade Bacia Hidrográfica Coordenadas Geográficas Salminus affinis (SA) SA_005 1 Rio Magdalena, Neiva, Colômbia Magdalena N W SA_009 1 Rio Magdalena, Neiva, Colômbia Magdalena N W SA_019 Rio Magdalena, Neiva, Colômbia Magdalena N W SA_020 Rio Magdalena, Neiva, Colômbia Magdalena N W SA_021 Rio Magdalena, Neiva, Colômbia Magdalena N W Salminus brasiliensis (SB) SB_571* 1 Rio Sepotuba, Mato Grosso, Paraguai S W SB_174 Riu Jaurú, Mato Grosso, Paraguai S W SB_187 Rio Sepotuba, Mato Grosso, Paraguai S W SB_194 Rio Paraguai, Mato Grosso, Paraguai S W SB_199 1 Rio Paraguai, Mato Grosso, Paraguai S W SB_252 Rio MogiGuaçu, São Paulo, Alto rio Paraná S W SB_263 Rio MogiGuaçu, São Paulo, Alto rio Paraná S W SB_264 Rio MogiGuaçu, São Paulo, Alto rio Paraná S W SB_284 Rio MogiGuaçu, São Paulo, Alto rio Paraná S W SB_294 Rio MogiGuaçu, São Paulo, Alto rio Paraná S W SB_268 Rio MogiGuaçu, São Paulo, Alto rio Paraná S W SB_302 Rio MogiGuaçu, São Paulo, Alto rio Paraná S W SB_309 Rio MogiGuaçu, São Paulo, Alto rio Paraná S W SB_356 Rio Turvo, São Paulo, Alto rio Paraná S W SB_373* Rio Turvo, São Paulo, Alto rio Paraná S W SB_355 Rio Turvo, São Paulo, Alto rio Paraná S W SB_373* Rio Turvo, São Paulo, Alto rio Paraná 20ᵒ25 24 S W SB_439 Rio Turvo, São Paulo, Alto rio Paraná 'S W SB_378 Rio Tietê, São Paulo, Alto rio Paraná S W SB_437* 1 Rio Tietê, São Paulo, Alto rio Paraná S W SB_396 Rio Jacarépepira, São Paulo, Alto rio Paraná S W

82 SB_426 Rio Paranapanema, São Paulo, Alto rio Paraná S W SB_427 Rio Paranapanema, São Paulo, Alto rio Paraná S W SB_436 Rio Paranapanema, São Paulo, Alto rio Paraná S W SB_455 Rio Paranapanema, São Paulo, Alto rio Paraná S W SB_458 Rio Paranapanema, São Paulo, Alto rio Paraná S W SB_480 Rio Paranapanema, São Paulo, Alto rio Paraná S W SB_498* Rio Paraná, Paraná, Alto rio Paraná S W SB_517 Rio Paraná, Paraná, Alto rio Paraná S W SB_537 Rio Paraná, Paraná, Alto rio Paraná S W SB_552 Rio Paraná, Paraná, Alto rio Paraná S W SB_577* 1 Rio Piracicaba, São Paulo, Alto rio Paraná S W SB_P2 Rio Uruguai, Rio Grande do Sul, Uruguai S W SB_P3 Rio Uruguai, Rio Grande do Sul, Uruguai S W SB_P67 Rio Uruguai, Rio Grande do Sul, Uruguai S W SB_P68 Rio Uruguai, Rio Grande do Sul, Uruguai S W SB_P69 Rio Uruguai, Rio Grande do Sul, Uruguai S W SB_P70 Rio Uruguai, Rio Grande do Sul, Uruguai S W SB_Y1 Rio Uruguai, Rio Grande do Sul, Uruguai S W SB_Y2 1 Rio Uruguai, Rio Grande do Sul, Uruguai S W SB_Y3 Rio Uruguai, Rio Grande do Sul, Uruguai S W SB_Y4 Rio Uruguai, Rio Grande do Sul, Uruguai S W SB_Y7 Rio Uruguai, Rio Grande do Sul, Uruguai S W SB_T125 Rio Uruguai, Rio Grande do Sul, Uruguai S W SB_L08 Rio Uruguai, Rio Grande do Sul, Uruguai S W SB_L10 Rio Uruguai, Rio Grande do Sul, Uruguai S W SB_L27 Rio Uruguai, Rio Grande do Sul, Uruguai S W SB_L40 Rio Uruguai, Rio Grande do Sul, Uruguai S W SB_326 Rio Caí, Rio Grande do Sul, Lagoa dos Patos S W 79 SB_339 1 Rio Ibicuí da Armada, Rio Grande do Sul, Uruguai S W

83 80 Salminus franciscanus (SF) SF_005 Rio São Francisco, Minas Gerais, São Francisco S W SF_007 Rio São Francisco, Minas Gerais, São Francisco S W SF_016 1 Rio São Francisco, Minas Gerais, São Francisco S W SF_027 Rio São Francisco, Minas Gerais, São Francisco S W SF_035* 1 Rio São Francisco, Minas Gerais, São Francisco S W SF_036* Rio São Francisco, Minas Gerais, São Francisco S W SF_104 Rio São Francisco, Minas Gerais, São Francisco S 45 51'36.67 W SF_116 Rio Corrente, Minas Gerais, São Francisco S 43 54'25.82 W Salminus hilarii (SH e SI) SH_002 1 Rio São Francisco, Minas Gerais, São Francisco S W SH_003 1 Rio São Francisco, Minas Gerais, São Francisco S W SH_004 Rio São Francisco, Minas Gerais, São Francisco S W SH_007 Rio São Francisco, Minas Gerais, São Francisco S W SH_008 1 Rio São Francisco, Minas Gerais, São Francisco S W SH_045 Rio São Francisco, Minas Gerais, São Francisco S W SH_160* 1 Rio São Francisco, Minas Gerais, São Francisco S W SH_009 1 Rio Peixe, Minas Gerais, São Francisco S W SH_022 Rio do Peixe, Minas Gerais, São Francisco 20 11'57.65 S 46 14'57.22 'W SH_025 Rio Peixe, Minas Gerais, São Francisco S W SH_026 Rio Peixe, Minas Gerais, São Francisco S W SH_010 Rio Samburá, Minas Gerais, São Francisco S W SH_018 Rio Samburá, Minas Gerais, São Francisco S W SH_035 Rio Samburá, Minas Gerais, São Francisco S W SH_042 Rio Samburá, Minas Gerais, São Francisco S W SH_061 Rio MogiGuaçu, São Paulo, Alto rio Paraná S W SH_070 Rio Cachoerinha, São Paulo, Alto rio Paraná 20 36'15.4 S 49 07'44.8 W SH_074* 1 Rio Ponte Nova, São Paulo, Alto rio Paraná S W SH_076* Rio Ponte Nova, São Paulo, Alto rio Paraná S W SH_078* Rio Ponte Nova, São Paulo, Alto rio Paraná S W

84 SH_068 Rio Turvo, São Paulo, Alto Paraná S W SH_069 Rio Turvo, São Paulo, Alto rio Paraná 20 22'39.2 S 49 16'38.8 W SH_079* Rio Turvo, São Paulo, Alto rio Paraná S W SH_082 Rio Turvo, São Paulo Alto rio Paraná S W SH_088 Rio Cubatão, São Paulo, Alto rio Paraná S W SH_091 Rio Cubatão, São Paulo, Alto rio Paraná S W SH_095 Rio Jacaré Pepira, São Paulo, Alto rio Paraná 22 15'54.13 S 48 13'44.85 W SH_100 Rio Jacaré Pepira, São Paulo, Alto rio Paraná 22 15'54.13 S 48 13'44.85 W SH_105 Rio Batalha, São Paulo, Alto rio Paraná S W SH_118 1 Rio Batalha, São Paulo, Alto rio Paraná S W SH_104 Rio QuebraAnzol, São Paulo, Alto rio Paraná S ;9 W SH_151 Rio do Carmo, São Paulo Alto rio Paraná 20 9'52.87 S 47 52'42.99 W SI_002* 1 Rio Araguaia, Mato Grosso, TocantinsAraguaia S W SI_005* Rio Araguaia, Mato Grosso, TocantinsAraguaia S W SI_010* 1 Rio Araguaia, Mato Grosso, TocantinsAraguaia S W SI_012* Rio Araguaia, Mato Grosso, TocantinsAraguaia S W SI_014* Rio Araguaia, Mato Grosso, TocantinsAraguaia S W SI_015* 1 Rio Madeira, Rondônia, Amazonas S W SI_016* Rio Madeira, Rondônia, Amazonas S W SI_017* 1 Rio Madeira, Rondônia, Amazonas S W SI_018 Rio Orteguaza, Caquetá, Colômbia Amazonas N W SI_019 Rio Orteguaza, Caquetá, Colômbia Amazonas N W SI_020 1 Rio Orteguaza, Caquetá, Colômbia Amazonas N W SI_022 Rio Orteguaza, Caquetá, Colômbia Amazonas N W SI_023 Rio Orteguaza, Caquetá, Colômbia Amazonas N W SI_024* 1 Rio Amazonas, Iquitos, Peru Amazonas S W SI_025* Rio Amazonas, Iquitos, Peru Amazonas S W SI_026* 1 Rio Amazonas, Iquitos, Peru Amazonas S W Brycon sp. B_15* 1 Rio Sepotuba, Mato Grosso, Paraguai S W 81

85 82 B_16* Rio Sepotuba, Mato Grosso, Paraguai S W *Vouchers; 1 Espécimes também utilizados para análise com o RAG2. Tabela 2. Média das distâncias genéticas, através do modelo de K2P, entre as oito MOTUs de Salminus. Em negrito, na diagonal, são os valores médios das distâncias intramotu S. affinis S. brasiliensis S. brasiliensis S. franciscanus S. hilarii S. hilarii S. sp. Araguaia S. sp. Amazonas

86 83 Fig.1. Bacias hidrográficas onde ocorrem as espécies de Salminus e os locais de coleta (símbolos amarelos): (1.1) Salminus affinis, círculos; (1.2) Salminus brasiliensis, quadrados; (1.3) Salminus hilarii, triângulos; e (1.4) Salminus franciscanus, estrelas.

87 84

88 85 Fig. 2. Topologias derivadas de duas abordagens de delimitações de espécies baseadas em 136 sequências COI de Salminus. (2.1) DNA barcoding tradicional: topologia de NJ com valores de bootstrap localizados acima dos ramos. (2.2) Topologia de IB com probabilidades posteriores. A barra vertical cinza indica o único ponto de transição entre os processos de especiação/extinção e coalescência, com máximo valor de verossimilhança. Apenas probabilidade maiores que 80% foram representadas. Ambas topologias foram construídas com sequências do banco de dados da BOLD (espécimes FUPR, BSB e FARGB) e as sequências produzidas neste trabalho; Símbolos representam as quatro espécies nominais: S. affinis (círculo), S. brasiliensis (quadrado), S. franciscanus (estrela) e S. hilarii (triângulo). Fig. 3. Comparação entre a distância COI intra e interespecífica utilizando as quatros espécies de Salminus atualmente válidas. Os quatro quadrantes indicados representam: (I) concordância entre a taxonomia atual e identificação molecular; (II) possível existência de espécies crípticas; (III) recente divergência, sinonímia ou hibridização; e, (VI) nenhuma correspondência entre taxonomia e identificação molecular.

89 86 Fig. 4. Topologia de IB do marcador RAG2 com 24 sequências (926 pb). Símbolos representam as quatro espécies nominais: S. affinis (círculo), S. brasiliensis (quadrado), S. franciscanus (estrela) e S. hilarii (triângulo). Número acima dos ramos representam probabilidades posteriores. Apenas probabilidades acima de 90% são representadas.

90 87 MATERIAL SUPLEMENTAR Tabela S1 Informação sobre os números de acesso* das sequências COI e RAG2. Espécies/ Espécimes Número de acesso COI (BOLD) Número de acesso RAG2 (GenBank) Salminus affinis (SA) SA_005 SA_009 SA_021 Salminus brasiliensis (SB) SB_199 SB_252 SB_339 SB_373 SB_437 SB_571 SB_577 SB_Y2 Salminus franciscanus (SF) SF_005 SF_016 SF_035 SF_036 Salminus hilarii (SH) SH_002 SH_003 SH_008 PBS04115 PBS04215 PBS01515 PBS01615 PBS01715 PBS01815 PBS01214 PBS01314 PBS01915 PBS02015 PBS02115 PBS02215 PBS02315 PBS00114 PBS00214 PBS02415 PBS02515 PBS02615 KT KP KP KP KP KP KP KP KP KP KP KP KP342013

91 88 SH_009 SH_010 SH_018 SH_025 SH_068 SH_074 SH_078 SH_079 SH_088 SH_118 SH_160 Salminus sp. Araguaia (SI) SI_002 SI_010 SI_014 Salminus sp. Amazonas (SI) SI_015 SI_016 SI_017 SI_019 SI_020 SI_024 SI_026 Brycon sp. PBS02715 PBS02815 PBS02915 PBS02515 PBS03115 PBS01014 PBS01114 PBS03215 PBS03315 PBS03415 PBS03515 PBS00314 PBS00514 PBS00714 PBS00814 PBS04315 PBS00914 PBS03615 PBS03715 PBS03815 PBS03915 KT KP KP KT KP KP KP KP KP KP KP B_15 PBS04015 KP * As sequências apresentadas nessa tabela foram publicadas na revista Systematics and Biodiversity.

92 89 Tabela S2: Média e máxima distância intraespecífica das espécies de Salminus, baseadas em K2P. Espécies Média intraespecífica Máxima intraespecífica S. affinis S. brasiliensis S. franciscanus S. hilarii Tabela S3: Modelos de evolução nucleotídica para cada partição por posição do códon determinados com Partition Finder 1.1.1, usando critério de informação bayesiana. Gene Modelos de evolução nucleotídica Bases COI primeira base do códon TrNef 1647/3 COI segunda base do códon HKY 2647/3 COI terceira base do códon K80+G 3647/3 RAG2 primeira base do códon K /3 RAG2 segunda base do códon K /3 RAG2 terceira base do códon K /3

93 90 Capítulo 2 Testando cenários biogeográficos: Abordagem bayesiana revela história evolutiva de peixes Neotropicais (A ser submetido para: Journal of Biogeography)

94 91 Testando cenários biogeográficos: Abordagem bayesiana revela história evolutiva de peixes Neotropicais Carolina de Barros Machado da Silva 1*, Ana Carolina Carnaval 2 e Pedro Manoel Galetti Jr 1. 1 Departamento de Genética e Evolução, Universidade Federal de São Carlos, São Carlos, SP, ,. 2 Department of Biology, City College of New York, 160 Convent Avenue, New York, NY 10031, USA *Correspondência: Carolina de Barros Machado da Silva, Departamento de Genética e Evolução, Universidade Federal de São Carlos, Rodovia Washington Luís, Km 235 SP310, São Carlos, SP, ,. Título curto: Testando hipóteses de diversificação em peixes Neotropicais Número de palavras: 6990 (Texto em inglês)

95 92 RESUMO Objetivos: Entre as principais hipóteses biogeográficas que explicam a notável diversidade da ictiofauna neotropical destacamse a paleogeográfica e a hidrogeológica. Apesar de refletirem processos diferentes podem resultar em um mesmo padrão. Com isso o objetivo do trabalho é utilizar abordagem bayesiana baseada em modelos para testar hipóteses alternativas e distinguir entre as assinaturas filogeográficas de vicariância e geodispersão na história evolutiva de peixes sulamericanos. Localização: América do Sul. Métodos: Nós empregamos marcadores moleculares para reconstruir a filogenia e estimar os tempos de divergência entre as espécies do gênero Salminus, associando os resultados com os eventos geoclimáticos conhecidos. Posteriormente, empregamos a computação bayesiana aproximada (ABC) para distinguir entre as assinaturas filogeográficas dos eventos. A principal diferença entre vicariância e geodispersão é que esta última apresentará uma assinatura de efeito fundador. Resultados: A filogenia revelou que Salminus affinis, única com distribuição transandina, é a espécieirmã de dois grandes grupos: Noroeste, formado por Salminus sp. Amazonas e Salminus sp. Araguaia, e Sudeste, constituído por Salminus brasiliensis, Salminus franciscanus e Salminus hilarii. O processo de diversificação entre as espécies se iniciou no Mioceno Superior e está associada a eventos de vicariância e geodispersão a que modelaram a paisagem hidrogeológica. A reconstrução de cenários, através da abordagem ABC, distinguiu que o evento de vicariância foi o responsável pela estrutura filogeográfica de S. brasiliensis e pela separação de S. sp. Araguaia e S. sp. Amazonas. Por outro lado, geodispersão foi o evento mais importante para a estruturação das linhagens de S. hilarii. Principais conclusões: Nós evidenciamos que as assinaturas filogeográficas de vicariância e geodispersão puderam ser detectadas em nosso modelo biológico. A correspondência entre os

96 93 resultados da análise ABC e da filogeografia tradicional sugerem confiança e robustez nos modelos desenhados e testados. A aplicabilidade do método ABC deve ser considerada em futuros estudos filogeográficos, uma vez que a análise foi capaz de testar hipóteses alternativas sobre a história demográfica das espécies, com base nas mudanças de tamanho populacional e diversificação populacional ao longo do tempo evolutivo. Palavras chaves: Análise ABC, América do Sul, diversificação evolutiva, geodispersão, Salminus, vicariância.

97 94 INTRODUÇÃO A análise e a compreensão sobre quais processos ecológicos e/ou geológicos foram responsáveis pela origem e organização da notável biodiversidade Neotropical tem sido alvo de uma quantidade considerável de estudos filogeográficos (Hubert et al., 2006; Weir, 2006; Antonelli & Sanmartín, 2011; Rull, 2011; CastroviejoFisher et al., 2013). Para explicar a diversidade de organismos e os complexos processos de diversificação na região Neotropical, várias hipóteses foram propostas (ver detalhes em Leite & Rogers, 2013). No entanto, muitos estudos filogeográficos estão direcionados a organismos terrestres e a questões sobre como os biomas sulamericanos evoluíram. Espécies de água doce, através de sua associação direta com as bacias hidrográficas, oferecem uma oportunidade única para estudar a dinâmica da paisagem hidrológica neotropical e sobre como processos geomorfológicos a moldaram (Sivasundar et al., 2001; MontoyaBurgos, 2003; Hubert & Renno, 2006; Hubert et al., 2007; Tagliacollo et al., 2015; Thomaz et al., 2015). Usando dados multiloci para espécies de Salminus, nós nos perguntamos como os eventos de vicariância e geodispersão impactaram a diferenciação das linhagens em sistemas aquáticos. Embora os principais sistemas aquáticos da América do Sul tenham começado seu desenvolvimento após a quebra da Gondwana ( 90 megaanum Ma), muitos deles atingiram a sua moderna configuração depois de terem sido fortemente influenciados pelo processo de soerguimento do norte dos Andes, ocorrido no Mioceno (12 10 Ma) (Hubert et al., 2007). Através da compressão tectônica, a orogênese dos Andes promoveu vários eventos de coalescência e ruptura de sistemas hidrográficos adjacentes (Lundberg et al., 1998; Hoorn et al., 2010), enquanto flutuações no nível do mar e mudanças climáticas impactaram também a conexão dos rios, porém durante o PlioPleistoceno (Albert et al., 2011).

98 95 Baseados nessas transformações da paisagem hidrológica, duas principais hipóteses têm sido empregadas para explicar sobre os processos alopátricos responsáveis pela diversificação de espécies dulcícolas neotropicais. A hipótese paleogeográfica tem focado no surgimento de barreiras impermeáveis, particularmente resultadas de rearranjos tectônicos, como um dos principais promotores de diversificação; estudos de paleoarcos da bacia Amazônica (Albert et al., 2006) são um dos exemplos. A hipótese hidrogeológica tem enfatizado capturas de cabeceiras entre bacias como um importante evento desencadeador de colonização de novas áreas com subsequente diferenciação (MontoyaBurgos, 2003; Hubert & Renno, 2006). Este cenário implica na remoção temporária da barreira entre bacias adjacentes, permitindo a mistura de assembleias locais, fluxo gênico e expansão de área um processo denominado de geodispersão (Ho et al., 2015; Tagliacollo et al. 2015). Embora ambos processos resultem em diferentes padrões biogeográficos, identificar se espéciesirmãs alopátricas divergiram por vicariância ou geodispersão pode ser uma tarefa desafiadora, particularmente quando novas barreiras emergem após capturas de cabeceira, ou em face de extinções locais (Burridge et al., 2006; Kodandaramaiah, 2010). Com base em recentes avanços nos métodos de genética de populações que testam hipóteses demográficas alternativas com base em dados multiloci, nós empregamos a abordagem de computação bayesiana aproximada (ABC 5, em inglês, Approximate Bayesian Computation; Beaumont et al., 2002; Beaumont 2010; Bertorelle et al., 2010) para distinguir entre as assinaturas filogeográficas de vicariância (hipótese paleogeográfica) vs. geodispersão (hipótese hidrogeológica) na história evolutiva de peixes sulamericanos do gênero Salminus. A monofilia do grupo (Abe et al., 2014), a grande capacidade migratória de suas espécies (Lima 5 A análise é baseada em uma classe de algoritmos que utiliza cadeia de Monte Carlos para fazer inferências baseadas em modelos (cenários). O método ABC ignora cálculos de verossimilhança, comuns em testes de hipóteses alternativas (Tagliacollo et al., 2015), passando a utilizar estatísticas sumárias e um volume grande de simulações. Essa mudança permite os usuários utilizarem muitos dados (microssatélites, SNPs e sequências) em cenários demográficos complexos para determinar qual história é mais provável (maior probabilidade posterior) para o organismo em questão (Cornuet et al., 2010).

99 96 & Britski, 2007) e sua disjunta distribuição ao longo das grandes bacias hidrográficas tornam o gênero um modelo biológico ideal para esclarecer o papel dos processos paleogeográficos e hidrogeológicos na diversificação dos peixes sulamericanos e questionar como as mudanças na paisagem local podem ter impactado na biota fluvial local. Para compreender como as mudanças da antiga paisagem impactaram o padrão de distribuição da diversidade de linhagens nas espécies de Salminus, nós utilizamos dois marcadores mitocondriais e dois nucleares para reconstruir as relações filogenéticas dentro do gênero, incluindo amostras de todas as unidades taxonômicas operacionais moleculares (MOTUs) definidas por Machado et al. (no prelo). Conforme outros estudos filogeográficos de sistemas aquáticos de água doce sulamericanos (Tagliacollo et al., 2015; Willis et al., 2015), nós usamos nossa árvore de espécies para estimar os tempos de divergência entre e dentro das espécies e associamos os resultados com os eventos geológicos conhecidos, assim sinalizando quais processos foram relevantes para a diversificação do grupo. Indo além de um estudo de associação, nós empregamos a abordagem estatística ABC para especificamente identificar qual cenário biogeográfico (paleogeográfico ou hidrogeológico) melhor explica a estrutura filogeográfica das linhagens de Salminus brasiliensis e Salminus hilarii, e o processo de divergência entre Salminus sp. Amazonas e Salminus sp. Araguaia. Nós esperamos que eventos de diversificação desencadeados por colonização, ou seja, aqueles facilitados por eventos de captura de cabeceiras (hipótese hidrogeológica), deixem como assinatura genética um efeito fundador em áreas colonizadas (Costello et al., 2003), uma vez que Salminus é encontrado na calha principal e um número reduzido de espécimes serão capturados. Por outro lado, diversificação causada por vicariância, conforme a hipótese paleogeográfica, não é esperada encontrar o efeito fundador (Fig. 1). Para verificar qual assinatura prevalece dentro das espécies de Salminus, nós simulamos cenários alternativos considerando mudanças no tamanho populacional ao longo

100 do tempo concomitantemente com a divergência das linhagens, e os comparamos com os nossos dados empíricos. 97 MATERIAL E MÉTODOS Amostragem de dados moleculares Nós amostramos 94 espécimes de Salminus, incluindo representantes de quatro espécies nominais (Salminus affinis, S. brasiliensis, Salminus franciscanus e S. hilarii) e duas novas potenciais espécies (S. sp. Amazonas e S. sp. Araguaia), identificadas em Machado et al. (no prelo) (Fig. 2, Tabela S1 na Informação de suporte). Sequências parciais de três regiões mitocondriais, Citocromo C Oxidase I (COI), Citocromo B (Cytb) e Dloop, e dois marcadores nucleares, o recombination activating gene (RAG2) e o íntron do gene ribosomal S7 (S7), foram amplificadas com primers descritos no Tabela S2. Condições das reações da cadeia de polimerase (PCR), purificações dos produtos de PCR e sequenciamento foram realizados conforme descrito por Machado et al. (no prelo). Todas as sequências mitocondriais e nucleares estão disponíveis no GenBank (ver Tabela S1 para os números de acesso). As sequências foram alinhadas e editadas no GENEIOUS R7 v6.1.6 ( Kearse et al., 2012). Devido à presença de indivíduos heterozigotos para inserções e/ou deleções em sequências do marcador S7 em S. brasiliensis, S. hilarii e S. sp. Amazonas, resultando em eletroferogramas com picos sobrepostos, nós também utilizamos o CodonCode Aligner v (CodonCode Corporation, Dedham, MA, USA). O software CodonCode Aligner é indicado para encontrar e processar os indivíduos heterozigotos, pois emprega dois diferentes algoritmos que extraem as sequências apropriadas para análise molecular. O processo é simples: fornecemos uma sequência referência (essa

101 98 sequência é escolhida a partir de indivíduos homozigotos) e a partir dos eletroferogramas com sobreposição de picos, os algoritmos criam pseudosequências. O indivíduo heterozigoto, portanto, apresentará duas sequências que o representará. No Geneious, nós utilizamos a ferramenta Achar heterozigotos, para todas as sequências nucleares com um limiar de 80%, com o objetivo de identificar posições ambíguas e assinalar códigos para bases degeneradas. Feito isso, prosseguimos com a reconstrução dos haplótipos com auxílio do programa PHASE 2.1 (Stephens & Donnely, 2003) e o aplicativo online SeqPhase (Flot, 2010). Inferência filogenética Antes de conduzir as análises filogenéticas, nós checamos a possibilidade da existência de recombinação para os marcadores RAG2 e S7 com o RDP3.44 (Martin & Rybicki, 2000). Também avaliamos a saturação das substituições para cada marcador através do Índice de Saturação de Substituição (Iss), baseado em entropia, estimado no DAMBE (ia, ie, Salemi, Chen, & Wang, 2003). Modelos de substituição nucleotídica foram determinados com o JModeltest (Posada, 2008) utilizando o critério de informação bayesiana (BIC) (Lanfear et al., 2012). Para inferência filogenética, nós empregamos o método baseado em coalescência de árvore de espécies (*BEAST) implementado no pacote BEAST 1.8 (Drummond et al., 2012). Espécimes do gênero Brycon foram utilizados para enraizar a árvore, seguindo Ortí & Meyer (1997). Devido à alta saturação, o Dloop foi excluído das nossas análises filogenéticas; a árvore de espécies foi então inferida com três loci independentes (dois genes mitocondriais combinados, COI e CytB, e os dois loci nucleares, RAG2 e S7). Como o *BEAST necessita de uma designação a priori sobre a identificação das espécies, nós tratamos as linhagens mitocondriais observadas para o COI e CytB (Fig. S2) como espécies candidatas. Seguindo essa afirmação temos: S. affinis, S. franciscanus, S. sp.

102 99 Amazonas e S. sp. Araguaia; nós dividimos S. brasiliensis e S. hilarii em cinco espécies candidatas: duas atualmente denominadas de S. brasiliensis (Alto Paraná e PUL Paraguai, Uruguai e Lagoa dos Patos) e três para S. hilarii (duas da bacia do São Francisco e uma do Alto Paraná) para inferir tempos de divergência entre e dentro das espécies (ver secção a seguir). Apesar das análises de DNA barcoding identificarem duas potenciais espécies para S. hilarii, as topologias mitocondriais, incluindo o Dloop identificaram três clados. Por essa razão, assumiremos três linhagens visando compreender as verdadeiras relações filogenéticas entre elas. Três cadeias independentes de Markov foram realizadas, iniciando a partir de árvores aleatórias, com um número de 200 milhões de gerações e amostradas a cada 10 mil gerações. Terminadas as corridas, nós as combinamos utilizando o LogCombiner 1.8, do pacote BEAST 1.8, e descartamos 25% das gerações (burnin). A mixagem apropriada dos dados foi verificada com o TRACER v1.5 (Rambaut & Drummond, 2007), e o tamanho efetivo da amostragem (ESS) de 200 ou mais foi necessário para parâmetros considerados importantes (probabilidade posterior, a priori e likelihood, e tempo do ancestral comum mais recente). Estimativas de tempos de divergência Os tempos de divergência foram estimados sob um relógio molecular relaxado com uma distribuição de lognormal no *BEAST 1.8. Nossa primeira tentativa para estimar os tempos de divergência foi a calibração a partir do único registro fóssil do gênero (Cione & Azpeculicueta, 2013). Entretanto, esta análise não providenciou resultados, uma vez que a probabilidade posterior da árvore inicial foi zero, impedindo o prosseguimento da cadeia. Esse problema sugere a existência de uma incompatibilidade entre os limites especificados na calibração e a variação molecular dos marcadores. Por esta razão, optamos pela calibração a partir de um evento biogeográfico. Utilizamos o soerguimento da cadeia Oriental da

103 100 Cordilheira dos Andes, que marca a separação entre as paleobacias do rio Magdalena e do Amazonas (11.8 Ma Hoorn et al., 1995), como o evento responsável pela divisão entre a espécie S. affinis e os demais Salminus. Os seguintes parâmetros para o relógio foram implementados na análise: distribuição normal para o prior do tempo de divergência do ancestral comum mais recente (MRCA, em inglês, most recent common ancestor) com média de 11.8 Ma e desvio padrão de 2 Ma (95% HPD, highest posterior density: 7.88 e Ma), distribuição uniforme (intervalo de 0 1) para o prior da taxa média do relógio (parâmetro ucld.mean) e modelo de especiação Yule. Para facilitar nossa compreensão sobre quais processos históricos são importantes, nós estimamos a área de distribuição dos ancestrais das espécies, através da abordagem de máxima verossimilhança empregada pelo pacote BioGeoBEARS (Biogeography with Bayesian and Likelihood Evolutionary Analysis in R scripts, Matzke, 2013) implementado no R. Para realizar a análise de estimativa de áreas ancestrais, nós fornecemos seis unidades hidrográficas: Magdalena (Mg), Amazonas (Am), TocantinsAraguaia (ToA), São Francisco (SFr), Alto Paraná (AP) e Paraguai, Uruguai e Lagoa dos Patos (PUL). O pacote BioGeoBEARS estima a distribuição geográfica dos nós ancestrais de uma filogenia calibrada. Uma otimização da função de verossimilhança é feita através da incorporação de uma série de parâmetros que descrevem a taxa ou o comprimento relativo de vários eventos biogeográficos, como expansão de área, extinção de área e cladogênese através da especiação por vicariância e simpatria. BioGeoBEARS compara os modelos que combinam diferentes parâmetros, utilizando o critério de informação Akaike (AIC) e peso do AIC 6 (AICw Matzke, 2013). 6 Embora o AIC seja reconhecido como o principal medidor para seleção de modelos, apresenta um inconveniente: os valores podem apresentar uma falta de clareza, apesar de valores elevados representarem menos qualidade de ajuste aos dados empíricos. O peso do AIC (AIC w) para o modelo é o valor de AIC divido pela soma de todos os modelos. Isso quer dizer que o valor de AIC w representa a probabilidade do melhor modelo, dado o conjunto de modelos testados (Wagenmaker & Farrel, 2004).

104 101 Seis modelos biogeográficos foram comparados no BioGeoBEARS: (I) DEC, modelo de dispersão, extinção e cladogênese que é igualmente empregado no LAGRANGE (Ree, 2005); (II) DEC com efeito fundador (DECj); (III) DIVALIKE, assim chamado por ser a versão do DIVA (dispersãovicariância) com o emprego da verossimilhança (Ronquist, 1997); (IV) DIVALIKE com efeito fundador (DIVALIKEj); (V) BayAreaLIKE, também com o emprego da verossimilhança (Landis et al, 2013); e, (VI) BayAreaLIKE com efeito fundador (BayAreaLIKEj). Nós permitimos o máximo de 3 áreas por nó, número máximo de bacias, da presente análise, que poderiam estar conectadas no passado (protoamazonas era constituído pelo Magdalena, Amazonas e TocantinsAraguaia Lundbert et al, 1998). A análise foi conduzida sem o grupo externo, pois este acarreta certas limitações para a metodologia (ver Yu et al., 2013). Após esses procedimentos, nós correlacionamos os tempos de divergência das espécies e linhagens com os eventos geoclimáticos conhecidos com a finalidade de elucidar quais processos históricos foram responsáveis pela diversificação de Salminus. Posteriormente, alguns desses eventos serão testados através de hipóteses alternativas. Testando cenários biogeográficos com Approximate Bayesian Computation (ABC) Nós empregamos todos os marcadores mitocondriais (COI, CytB e Dloop) e nucleares (RAG2 e S7) na estatística ABC (Beaumont et al., 2002) para testar qual cenário biogeográfico melhor corresponde à estrutura filogeográfica das espécies, fortemente suportadas por nossas análises filogenéticas (ver resultados): S. brasiliensis do Alto rio Paraná e S. brasiliensis dos rios Paraguai, Uruguai e Lagoa dos Patos (PUL); S. hilarii do Alto Paraná e duas linhagens reciprocamente monofiléticas de S. hilarii da bacia do rio São Francisco); e, S. sp. Amazonas e S. sp. Araguaia. Essas espécies foram escolhidas para o teste

105 de cenários, pois na primeira etapa das análises (estimativa de tempo e a correlação com eventos conhecidos) ambos cenários biogeográficos se mostraram prováveis (ver resultados). 102 Definindo os cenários: Usando DIYABC v2.0.4 (Cornuet et al., 2014), nós testamos duas classes de cenários biogeográficos independentemente para cada espécie descrita acima: um cenário de geodispersão representando a hipótese hidrogeológica e outro cenário de vicariância correspondendo a hipótese paleogeográfica (Fig. 1). Para cada cenário, as populações atuais foram configuradas para o tempo t0, e a divergência entre elas para o tempo t3. No caso das linhagens de S. brasiliensis e das espécies de S. sp. Amazonas e S. sp. Araguaia os cenários foram desenhados da seguinte maneira: para o cenário de vicariância, assumimos uma população ancestral, com tamanho efetivo denominado Na, que se dividiu em duas populações de tamanho efetivo menor que Na (N1 e N2) no tempo t3. Essas populaçõesfilhas evoluíram independentemente e no tempo t0 representam linhagens, no caso de S. brasiliensis, ou espécies diferentes, no caso de S. sp. Amazonas e S. sp. Araguaia. O cenário de geodispersão assume que um pequeno número de fundadores (N1f e N2f, onde f significa fundador), originado a partir de uma baciafonte, colonizou a bacia adjacente depois de um evento de captura de cabeceira em t3 e consequente expansão populacional em t1. Há dois cenários dentro desta classe porque assumimos que a identidade da baciafonte pode ser diferente. Assim como a classe do cenário de vicariância, as populações evoluíram independentemente depois do evento fundador até o tempo t0. A grande diferença entre os dois cenários é a mudança do tamanho efetivo das populaçõesfilhas em t3 (Fig. 1, 3 ab). No caso de S. hilarii, a qual é possível observar três linhagens mitocondriais bem definidas nas topologias (Fig. S2 duas da bacia do rio São Francisco e uma do Alto rio Paraná), nós adicionamos mais parâmetros (ts tempo de divergência entre as linhagens simpátricas da bacia do rio São Francisco e número de populações) e adaptamos os cenários. A escolha do

106 103 melhor cenário, para a espécie, foi feita em duas etapas: Inicialmente, cada classe de cenário biogeográfico foi testada separadamente (geodispersão com o rio São Francisco sendo a baciafonte; geodispersão com o Alto Paraná sendo a baciafonte; e, o cenário de vicariância Fig. S1 e resultados estão no Tabela S3 na informação suporte). A necessidade de cada classe ser testada separadamente se deve à presença das duas linhagens do São Francisco (SF1 e SF2), uma vez que a identidade de qual linhagem participou do evento t3 também é importante. Portanto, existem dois modelos para cada classe. A segunda etapa comparou os modelos com maior probabilidade posterior de cada classe de cenário estimada na primeira rodada para decidir qual cenário reflete a história evolutiva da espécie (Fig. 3c). Distribuição dos priors dos parâmetros e estatísticas sumárias. Todos os parâmetros (tamanho populacional, tempo dos eventos demográficos e taxas mutacionais) e distribuição dos priors utilizados em nossos cenários estão sumarizados no material de suporte (Tabela S4). Os valores dos priors de tamanho populacional efetivo foram considerados com distribuição uniforme. Os priors das estimativas de tempo foram medidos em gerações e os valores foram baseados na árvore de coalescência (árvore de espécie gerada no *BEAST). Nós utilizamos dois anos como o tempo de geração para todas as espécies, baseado nos dados ecológicos de machos da espécie S. brasiliensis (Godoy, 1975). A taxa média de mutação (por sítio por geração) foi atribuída para cada locus com distribuição uniforme, variando de 10 9 a 10 8 para os marcadores nucleares e de 10 8 a 10 7 para os mitocondriais (Cornuet et al., 2010). Para a comparação dos cenários, nós empregamos as seguintes estatísticas sumárias (dados de diversidade genética): número de haplótipos e número de sítios segregantes dentro de cada população, e número de haplótipos e Fst (índice de fixação) entre as populações. Cada cenário competidor foi simulado um milhão de vezes.

107 104 Comparação de cenários. Para determinar o cenário mais provável, nós computamos a probabilidade posterior dos três cenários competidores utilizando uma regressão logística com análise linear discriminante (Cornuet et al., 2010) em 1% dos dados simulados que estão próximos aos dados observados. Cenários vencedores possuem alto valor de probabilidade posterior com 95% HPD sem sobreposição com as probabilidades posteriores dos demais cenários. Para investigar a robustez do cenário vencedor, isto é, se ele foi escolhido corretamente, nós avaliamos as taxas de erro tipo I (a probabilidade que os dados simulados sob um cenário vencedor foram incorretamente atribuídos a outro cenário) e erro tipo II (a probabilidade que o conjunto de dados simulados sob um outro cenário foram atribuídos ao cenário vencedor). Para essa etapa, 500 pseudodados observados (dados simulados) foram produzidos por cenários, com os valores dos parâmetros gerados a partir da informação dada na etapa Distribuição dos priors dos parâmetros e estatísticas sumárias. As probabilidades posteriores dos cenários competidores foram avaliadas para cada conjunto de pseudodados observados, usando a metodologia descrita para os dados observados. Estimativa e precisão dos parâmetros e checagem do modelo. Depois de definir o cenário vencedor em cada espécie, estimamos os valores dos parâmetros desse cenário através de uma regressão linear local (Beaumont et al., 2002) utilizando 1% dos dados simulados, e aplicando a transformação logit para todos os parâmetros (Cornuet et al., 2008). Nós avaliamos a precisão de cada parâmetro estimado através do cálculo da média relativa do erro absoluto (RMAE, em inglês, relative median of the absolute error), que é a média do erro absoluto divido pelo valor do parâmetro verdadeiro dos 500 pseudodados observados. Finalmente, nós realizamos uma etapa de verificação do modelo para avaliar como o cenário vencedor se encaixa com os dados observados. Para isso, realizamos uma simulação de pseudodados observados para o cenário vencedor. As estatísticas sumárias empregadas nessa

108 105 etapa precisam ser diferentes daquelas já empregadas, para evitar uma sobreestimativa dos resultados (Cornuet et al., 2010). Nós utilizamos a variância das diferenças parapar e D de Tajima como estatística sumária nas análises dentro da população, e número de sítios segregantes e média das diferenças parapar dentro (W) e entre (B) amostras para estimações entre populações. Uma análise de componentes principais (PCA, em inglês, principal components analysis) aplicada em vetores de testes estatísticos foi utilizado para visualmente se observar como ocorre o encaixe entre dados simulados e observados. RESULTADOS Relações filogenéticas entre as espécies de Salminus A filogenia do gênero inferida a partir dos marcadores moleculares COI, CytB, S7 e RAG2 mostrou que todas as espécies do gênero (4 espécies nominais válidas e duas candidatas, S. sp. Amazonas e S. sp. Araguaia) são monofiléticas. Ao compararmos as topologias dos genes, entretanto, observamos várias inconsistências quanto ao nó basal e a monofilia de S. brasiliensis (Fig. S2). As topologias dos marcadores mitocondriais, que apesar de formarem os mesmos agrupamentos, apresentaram configurações diferentes, evidenciando a parafilia das linhagens de S. brasiliensis (Alto Paraná e PUL) e o clado basal constituído por S. sp. Amazonas e S. sp. Araguaia, suportado apenas pelo COI. Por outro lado, o marcador nuclear S7 mostrou a espécie S. brasiliensis como sendo monofilética. RAG2 não possuiu resolução para definir como as linhagens de S. brasiliensis estão relacionadas. Diferente do observado para COI, RAG2 suporta S. affinis como a espécie posicionada na base da topologia (Fig. S2). A árvore de espécies (Fig. 4) evidenciou S. affinis, única espécie transandina, como e espécieirmã dos demais Salminus, que formam dois grandes clados com alto valor de

109 106 suporte. O primeiro clado, denominado grupo Noroeste, é constituído por S. sp. Amazonas e S. sp. Araguaia. O outro clado é composto por S. brasiliensis, S. franciscanus e S. hilarii, e foi denominado de grupo Sudeste. No grupo Noroeste, S. sp. Amazonas apresenta amostras de diferentes localidades: Alto rio Amazonas e rio Madeira. Entretanto o suporte estatístico entre ambas foi baixo (Nó 4, 0.68). Por esta razão nós iremos considerar essas populações como uma única linhagem, denominada Amazonas, no teste de hipóteses biogeográficas (secção Análise ABC). No grupo Sudeste, S. franciscanus é a espécieirmã de S. brasiliensis e S. hilarii. O valor do suporte do nó (6) entre essas duas últimas foi considerado baixo (0.6). O mesmo ocorre entre as linhagens simpátricas de S. hilarii da bacia do São Francisco (Nó 9, 0.90) (Fig. 4). Tempos de divergência entre as espécies de Salminus A análise do relógio molecular sugere que os processos de diversificações em Salminus iniciaram no Mioceno Superior (Fig. 4). O MRCA de Salminus, calculado a partir do evento biogeográfico descrito anteriormente, nó 1, viveu há aproximadamente Ma, com um intervalo de confiança (95% HPD) de Ma. O seguinte evento de divergência foi entre o grupo Noroeste (bacias dos rios Amazonas e Araguaia) e o grupo Sudeste (Bacia Platina rios Paraná, Paraguai e Uruguai Lagoa dos Patos e do rio São Francisco) que ocorreu há 7.76 Ma (95% HPD Ma). Os demais processos de diversificação ocorreram durante o Plioceno Inferior. Nós também estimamos temporalmente a diversificação das linhagens de S. brasiliensis (as linhagens Alto Paraná e PUL divergiram há 0.36 Ma, 95% HPD Ma) e S. hilarii (as linhagens presentes no Alto Paraná e São Francisco se separaram há 1.36 Ma, 95% HPD Ma; e as linhagens simpátricas da bacia do São Francisco divergiram há 0.68 Ma, 95% HPD Ma). Para S. sp.

110 107 Amazonas e S. sp. Araguaia a divergência ocorreu há Ma, 95% HPD Ma (Fig. 4). Dos seis modelos biogeográficos testados pelo BioGeoBEARS, o modelo de dispersão e vicariância com efeito fundador (DIVALIKEj) apresentou o melhor ajuste aos dados empíricos, sendo suportado por AICw (>0.90). O resultado sugeriu que a área de distribuição mais provável do MRCA de todos os Salminus tenha sido na região do protoamazonas (rios Magdalena, Amazonas e TocantinsAraguaia Fig. S3). O modelo recuperou também que o ancestral dos grupos Noroeste e Sudeste estava presente no paleoamazonas (rios Amazonas e Tocantins Araguaia). O ancestral do grupo Noroeste continuou no paleoamazonas onde divergiu para formar S. sp. Araguaia e S. sp. Amazonas. Já o ancestral do grupo Sudeste estava no rio São Francisco e posteriormente alcançou as demais bacias do escudo eiro (rios Paraná, Paraguai, Uruguai e Lagoa dos Patos). Testando hipóteses biogeográficas com análise ABC para S. brasiliensis, S. hilarii, e S. sp. Amazonas e S. sp. Araguaia A reconstrução demográfica utilizando a abordagem ABC identificou o cenário de vicariância (hipótese paleogeográfica) como o evento mais provável para explicar a estrutura filogeográfica atual de S. brasiliensis e a divergência entre S. sp. Amazonas e S. sp. Araguaia (probabilidade posterior, P, foi e , respectivamente). Por outro lado, o cenário de geodispersão (hipótese hidrogeológica) foi o evento mais provável para explicar a estrutura de S. hilarii (P=0.8312) (Tabela 1). Embora o cenário vencedor de cada espécie tenha apresentado altas taxas de erro do tipo I, as taxas de erros do tipo II foram baixas (Tabela S5) sugerindo alta confidência no cenário escolhido pela análise ABC. Valores posteriores dos parâmetros foram estimados apenas para os cenários vencedores (Tabela 2). No cenário de vicariância de S. brasiliensis, o

111 108 tamanho médio efetivo das linhagens do Alto Paraná e PUL foram NAP = (95% HPD ) e NPUL = (95% HPD ), respectivamente. Ambas linhagens divergiram de uma população ancestral com tamanho médio efetivo de (95% HPD ) no tempo t3=0.892 Ma (95% HPD Ma). Para as espécies S. sp. Amazonas e S. sp. Araguaia, o cenário com a maior probabilidade posterior mostrou uma população ancestral (Na=582000, 95% HPD ) sofrendo uma divisão no tempo t3= 2.36 Ma (95% HPD Ma). A média dos tamanhos efetivos das linhagens no presente (t0) foi de indivíduos (95% HPD ) para S. sp. Amazonas (NAM) e (95% HPD ) indivíduos S. sp. Araguaia (NToA) (Tabela 2). O cenário vencedor para S. hilarii assumiu que bacia do Alto rio Paraná, capturou parte da bacia do rio São Francisco (baciafonte). Esta geodispersão ocorreu há Ma (t3, 95% HPD Ma). Um pequeno número de fundadores (NAPf = 5040, 95% HPD ), originado a partir da linhagem denominada SF1 da bacia do rio São Francisco, colonizou o Alto rio Paraná e se expandiu há Ma (95% CI Ma). Devido a existência de duas linhagens dentro da bacia do rio São Francisco, nós também estimamos o tempo de divergência entre elas (SF1 e SF2) (ts= Ma, 95% HPD Ma). O processo biogeográfico responsável por esta divergência não foi especificado porque as linhagens são simpátricas e os cenários testados resultam de diversificação alopátrica. Os tamanhos efetivos médios no presente (t0) para a linhagens foram NSF1=446000, NSF2= e NAP= (Tabela 2). Avaliando o desempenho da estimativa da distribuição posterior dos parâmetros, exceto NAPf (tamanho da população fundadora 0.835) e NSF2 (tamanho populacional da linhagem 2 da bacia do rio São Francisco 0.337), ambos calculados para S. hilarii,

112 mostraram baixos valores RMAE. Isso indica que os parâmetros estimados para a análise ABC, nos cenários vencedores, são confiáveis (Tabela 2). 109 DISCUSSÃO Filogenia de Salminus A investigação das relações evolutivas entre as espécies de Salminus refutou as hipóteses propostas previamente, baseada em caracteres morfológicos (Lima, 2006) e em evidência molecular (Abe et al., 2014). Em tese não publicada, Lima (2006) não obteve caracteres morfológicos suficientes para estabelecer todas as relações entre as espécies. Entretanto, revelou que S. brasiliensis e S. franciscanus são espéciesirmãs, assim como S. affinis e S. sp. (para o autor, S. sp. Amazonas e S. sp. Araguaia formam uma única espécie). Essa hipótese é suportada por Abe et al. (2014), que adicionalmente propõe S. hilarii como espécie irmã dos demais Salminus, cenário bem diferente daquele que estamos propondo (Fig. 4). Com o intuito de compreender as razões pelas quais os dados moleculares são divergentes, nós reanalisamos individualmente as árvores gênicas utilizando apenas os Salminus amostrados em Abe et al. (2014) (dados não mostrados). Entre os marcadores utilizados pelos autores, apenas o RAG2 apresentou uma topologia distinta em relação aos demais marcadores: S. hilarii está situada na base da topologia. Essa configuração não era esperada, afinal em todos os marcadores, inclusive em nossos dados, S. hilarii apresenta uma estreita relação com S. franciscanus e S. brasiliensis. Diante dessa incongruência, nós decidimos realizar uma nova análise utilizando todas as sequências do RAG2 disponíveis para a família Bryconidae no GenBank (Oliveira et al., 2011; Abe et al., 2014), incluindo também a do presente estudo. Os resultados revelaram que o único espécime de S. hilarii utilizado por

113 110 Abe et al. (2014) não agrupa com os Salminus, cujo suporte de agrupamento é máximo. Esse espécime está agrupado com os demais espécimes de Brycon. Por essa razão, acreditamos que para o RAG2 essa sequência tenha sido erroneamente denominada como S. hilarii, quando na verdade tratase de um espécime do gênero Brycon. Pelo fato dos genes nucleares oferecerem maior resolução para os nós mais antigos da topologia, esse erro provocou uma resolução equivocada sobre as relações evolutivas entre as espécies de Salminus. Diante desse problema, a filogenia molecular do gênero Salminus apresentada neste estudo é mais coerente, sendo a primeira com ampla amostragem e distribuída em distintas bacias hidrográficas, capaz de detectar as estruturações intraespecíficas e resolver as relações interespecíficas. A análise multiloci corroborou a hipótese de que existem mais unidades evolutivas do que espécies nominais (Abe et al., 2014; Machado et al., no prelo). Segundo Abe et al., (2014) Salminus estaria constituído por cinco unidades fortemente sustentadas (S. affinis, S. brasiliensis, S. franciscanus, S. hilarii e S. sp.). Por outro lado, para Machado et al. (no prelo) a análise de DNA barcoding associada ao marcador nuclear RAG2 suportou a existência de seis unidades (S. affinis, S. brasiliensis, S. franciscanus, S. hilarii, S. sp. Amazonas e S. sp. Araguaia), assim como os resultados do presente estudo. A diferença no número de unidades evolutivas se deve unicamente ao fato de Abe et al. (2014) terem usado um único indivíduo para representar as espécies, não sendo possível detectar que S. sp. é constituída por duas unidades (S. sp. Amazonas e S. sp. Araguaia). Há dois pontos divergentes entre os nossos resultados e Machado et al. (no prelo). O primeiro deles é a parafilia de S. brasiliensis. Machado et al. (no prelo) empregando as análises de DNA barcoding fortemente sustentou a existência de duas unidades em S. brasiliensis. No entanto, como o marcador nuclear (RAG2) não foi elucidativo, os autores recomendaram cautela quanto à definição do real status taxonômico da espécie. A análise multiloci do presente estudo, não evidenciou a parafilia de S. brasiliensis. Por hora, concluímos que esta espécie deve ser considerada uma única unidade

114 111 taxonômica com estruturações filogeográficas que resultaram de um processo de diversificação alopátrica (ver demais secções). Outro ponto divergente foi a recíproca monofilia observada no presente trabalho entre indivíduos de S. hilarii das bacias do rio São Francisco e Alto rio Paraná (Fig. 4). Diferentemente, para Machado et al. (no prelo), essa monofilia recíproca não existe: há duas unidades mitocondriais, uma constituída apenas por indivíduos da bacia do rio São Francisco e outra formada por espécimes do Alto rio Paraná e uma parte do rio São Francisco. Os autores sugerem que a nãomonofilia recíproca das bacias hidrográficas seja resultado de um contato secundário (histórico, mais provável, ou por ação antrópica). Os três marcadores mitocondriais que utilizamos também confirmaram a não monofilia recíproca, apesar de identificar três e não duas linhagens mitocondriais. Portanto, confirmamos a hipótese de contato secundário, detectada apenas pelos mitocondriais, marcadores que providenciam sinais de eventos de diferenciação mais recentes do que os nucleares (ver discussão sobre História evolutiva do gênero). Todas as relações interespecíficas foram fortemente suportadas, a exceção foi entre S. brasiliensis e S. hilarii (nó 6, P=0.6). Acreditamos que essa baixa probabilidade bayesiana posterior reside na incongruência entre as árvores mitocondriais e nucleares. Para testar essa hipótese, realizamos o teste ILD (Incongruence Length Difference test Farris et al., 1994) utilizando o método de Máxima Parcimônia no PAUP* v4.0b10 que avalia o conflito e a incongruência entre as partições (genes) utilizadas nesta análise. O valor de P<0.01 rejeitou a hipótese nula de que ambos genomas são congruentes. Conflitos entre filogenias mitocondriais e nucleares são comuns e surgem devido a vários processos (ver Dávalos et al., 2012). Provavelmente, para o nosso conjunto de dados, essas diferenças sejam resultantes de características intrínsecas de cada genoma (Funk & Omland, 2003). Contudo, como apenas o S7 apresenta resolução dessa relação interespecífica, identificando a monofilia de S.

115 brasiliensis, ao contrário dos outros dois marcadores mitocondriais, não descartamos a possibilidade de estarmos diante de um caso de ILS para esse marcador nuclear. 112 História evolutiva de Salminus O primeiro ponto de diversificação observado na topologia do gênero foi o nó (1) calibrado através do evento biogeográfico. O ancestral comum mais recente do gênero Salminus data do Mioceno Superior (11.05 Ma, 95% HPD Ma) e estava distribuído por todo protoamazonas (Fig. 4, Fig. S3). Antes do soerguimento da Cadeia Oriental dos Andes, não havia individualização das bacias hidrográficas modernas no noroeste do continente sulamericano. Esta região estava coberta por um sistema de lagos, cujo conjunto foi denominado de Lago Pebas (Lundberg et al., 1998). Aproximadamente a 11.8 Ma, a direção do fluxo das águas da várzea do Magdalena mudou completamente de sentido: do leste/sudeste para oeste. Esta troca de sentido indica a existência de uma nova e importante área a leste (Cordilheira Oriental dos Andes), resultante da colisão entre as placas Nazca com a margem noroeste da América do Sul (Hoorn et al., 1995). O surgimento da cadeia de montanhas contínuas separou permanentemente as populações do ancestral de Salminus. Esse cenário de vicariância é extensivamente discutido para a explicar as divergências entre a ictiofauna cis e transandina (Sivasundar et al., 2001; MontoyaBurgos, 2003; Albert et al., 2006). Após o soerguimento da cadeia Oriental dos Andes, parte da população ancestral se diverge na bacia do Magdalena, dando origem à S. affinis, e parte continua no Lago Pebas. Como resultado dessa orogênese andina ocorre a erosão do Arco Purus, uma importante barreira que dividia o paleoamazonas em duas porções: leste, que desaguava no oceano Atlântico, e oeste, que desaguava no Mar do Caribe (Lundberg et al., 1998). Com o estabelecimento do curso moderno do paleoamazonas (oesteleste), essas populações

116 113 ancestrais alcançam o paleotocantinsaraguaia. É após esses eventos que outra cladogênese ocorre dentro do gênero Salminus (nó 2), marcando a separação do grupo Noroeste (bacias dos rios Amazonas e TocantinsAraguaia) e Sudeste (bacias dos rios Paraná, Paraguai, São Francisco e Uruguai e drenagem da Lagoa dos Patos) (Fig. 4). O MRCA dos dois grupos estava no paleoamazonas/tocantinsaraguaia há 7.76 Ma (95% HPD Ma), onde parte dele geodispersou para as bacias do Escudo brasileiro, provavelmente através de uma captura de cabeceira para a bacia do rio São Francisco (formando o grupo Sudeste), e parte continuou na região, dando origem ao grupo Noroeste (Fig. 4, Fig. S3). A história biogeográfica da ictiofauna do TocantinsAraguaia e São Francisco são distintas. Enquanto a ictiofauna do rio Tocantins é próxima à amazônica, a do São Francisco é híbrida, apresentando relações com as bacias hidrográficas adjacentes (Lima & Caires, 2011). Entre ambas existe a Serra Geral do Tocantins, uma estrutura tectônica datada desde o Cretáceo que separa as cabeceiras dessas bacias (Villela & Nogueira, 2011). O processo de erosão da serra criou um fenômeno chamado de águas emendadas, onde as duas bacias compartilham cabeceiras. É provável que há 7.76 Ma tenha ocorrido um processo de geodispersão nessa região para o São Francisco, permitindo a expansão de um grupo que se tornará o ancestral do grupo Sudeste. Outra provável rota de geodispersão histórica entre os dois sistemas hidrográficos é pela costa nortenordeste. De acordo com Hubert et al. (2007), dois eventos de geodispersão entre as paleobacias ocorreram no gênero Serrasalmus: um há 7.4 Ma (coincidente com nossa estimativa temporal) e outro há 2.3 Ma. Os autores argumentaram que a regressão marinha do Mioceno promoveu a coalescência das fozes dos paleorios, criando conexões temporárias entre os paleorios amazônicos e do nordeste brasileiro, favorecendo a expansão de área do ancestral para o Escudo eiro. Hubert & Renno (2006), a partir da compilação de dados de distribuição de 601 espécies de Characiformes, também identificaram essa rota.

117 114 Conforme a sequência de eventos descrita anteriormente, o ancestral do grupo Noroeste permaneceu no paleoamazonas. O evento de cladogênese desse grupo (nó 3) ocorreu há 2.7 Ma (95% HPD Ma) e marca a separação entre S. sp. Araguaia e S. sp. Amazonas (Fig. 4). Essa separação provavelmente está relacionada com o rompimento da conexão entre as paleobacias do Amazonas e TocantinsAraguaia. Dados geológicos e geomorfológicos indicam que a intensa atividade neotectônica das falhas geológicas no baixo Amazonas (local onde hoje existe a foz de ambos os rios), culminou na mudança de rota do paleotocantins durante o PlioPleistoceno (Rossetti & Valeriano, 2007). Essa interrupção na descarga direta do paleotocantins dentro do paleoamazonas, foi apontada como um evento de vicariância responsável pela especiação entre as espécies Inia araguaiaensis (botodoaraguaia) e Inia geofrensis (botocorderosa) há 2.08 Ma (95% HPD Ma) (Hrbek et al., 2014), coincidindo com nossos resultados. Entretanto, a análise do BioGeoBEARS aponta um cenário diferente para o clado Noroeste (Fig. S3). A área ancestral foi estimada como sendo no rio Amazonas, o que resultaria na ocorrência de um evento de captura de cabeceira entre o Amazonas e o Tocantins, após o estabelecimento das bacias. Claramente é um artefato da análise, que não leva em consideração o dinamismo das conexões das bacias hidrográficas. Apesar de algumas evidências de captura de cabeceira entre o rio TocantinsAraguaia e a bacia adjacente do rio ingu (tributário do rio Amazonas) (Lima & Caires, 2011), nós não acreditamos que esse cenário tenha ocorrido no grupo. A razão está na distribuição atual disjunta do gênero dentro da bacia Amazônica: os registros apontam espécimes presentes apenas nas regiões mais altas do Ocidente do rio Amazonas (rios Madeira, Ucayali, Juruá, Marañon e Purus) e Tocantins Araguaia (Lima, 2006). Os padrões biogeográficos de espécies com essa distribuição disjunta e relacionadas a altitude ainda não foram elucidados, porém, de acordo com Lima e Ribeiro (2011) estão relacionados à constraints ecológicos e eventos históricos. Para esclarecermos se

118 115 o cenário de geodispersão pode ou não ter ocorrido, iremos testálo como um cenário alternativo através da abordagem ABC. Os eventos de cladogênese do grupo Sudeste, envolvendo as bacias do Alto rio Paraná e rio São Francisco, não são característicos de especiação por vicariância, mas sim por sucessivas geodispersões, uma vez que as bacias hidrográficas não formam grupos monofiléticos (Hubert et al., 2007). A estrutura geológica do Escudo eiro favorece esses eventos, com suas inúmeras falhas geológicas que continuamente estão sendo reativadas, promovendo rearranjos entre as bacias e consequente troca de ictiofauna (Ribeiro, 2006, Buckup, 2011; Ribeiro & Menezes 2015). O surgimento da bacia do rio São Francisco e do Alto rio Paraná é muito antigo, remonta o tectonismo associado à quebra da Gondwana (Potter, 1997, Ribeiro, 2006). Entre as cabeceiras dessas bacias existe um sistema de falhas geológicas conhecido como Descontinuidade Crustal do Alto Rio São Francisco (DCARSF), que apresenta atividade recorrente desde o PréCambriano (Saadi, 1993). Com as contínuas reativações da DCARSF, as geodispersões se tornaram importantes eventos promotores de diversificação dentro dos gêneros Salminus, Hypostomus ( Ma MontoyaBurgo, 2003) e alguns Characiformes (Hubert & Renno, 2006). O MRCA do grupo Sudeste estava no paleorio São Francisco há 4.27 Ma (95% HPD Ma), quando parte dele se geodispersou para o Alto rio Paraná (estimativa de área ancestral para o MRCA das espécies S. hilarii e S. brasiliensis Fig. S3). S. brasiliensis apresenta duas linhagens alopátricas bem definidas, cujo processo de diversificação entre elas deve estar relacionado à separação das bacias hidrográficas que ocupam (Alto rio Paraná e os rios Paraguai, Uruguai e drenagem da Lagoa dos Patos). Espécies com a distribuição similar à S. brasiliensis também apresentam essa estruturação entre o Alto rio Paraná e os demais sistemas da Bacia Platina (Sivasundar et al.; 2001; Bellafronte et al., 2013; Piálek et al., 2012). O Alto rio Paraná, dado sua composição de

119 116 espécies, características ecológicas e história evolutiva, é considerada uma distinta ecorregião em relação às bacias do Baixo rio Paraná, rios Paraguai e Uruguai (Abell et al., 2008). A história biogeográfica da região é complexa e está associada com sucessivas reativações de fraturas geológicas (Bartorelli, 2004). Essas reativações neotectônicas promoveram tanto rearranjos entre essas drenagens (Ribeiro & Menezes, 2015) quanto a formação de importantes barreiras geográficas (cachoeiras de Apipé, Iguaçu, Moconá e Sete Quedas, por exemplo Bartorelli, 2004). Portanto, dois distintos cenários explicariam a diversificação das linhagens de S. brasiliensis, que ocorreu há 0.36 Ma (95% HPD Ma): vicariância e geodispersão. A cachoeira de Sete Quedas, antes do seu afogamento para a construção do reservatório de Itaipu, foi uma importante barreira geográfica impermeável entre o Alto rio Paraná e as demais sistemas hidrográficos que compõem a bacia Platina. Não existe informação sobre a idade absoluta dessa cachoeira. Segundo Bartorelli (2004), eventos neotectônicos do Pleistoceno Médio até o último máximo glacial ( Ma) foram os responsáveis pelas gêneses de cachoeiras na bacia do rio Paraná. É provável que com o surgimento de Sete Quedas durante esse período, a população ancestral das linhagens de S. brasiliensis, que estava distribuída por toda a bacia Platina, tenha ficado isolada e divergido alopatricamente. Esse evento de vicariância também é utilizado para explicar os processos de diversificação em Prochilodus lineatus (Sivasundar et al., 2001) e no grupo Crenicichla lacustris (Piálek et al., 2012). Apesar de pouco provável, devido às estimativas temporais, nós não descartamos o cenário de geodispersão, que poderia ter ocorrido do Alto rio Paraná para o rio Paraguai. Ambas as bacias possuem cabeceiras adjacentes que poderiam ter sido utilizadas como paleorotas. De acordo com Menezes et al. (2008), as paleorotas teriam surgido durante o processo tectônico de formação do Pantanal, planície alagada encontrada no Alto rio Paraguai. Os

120 117 autores destacam que o limite oeste do Alto rio Paraná era mais deslocado para o Ocidente do que atualmente, e que após a reativação de uma falha tectônica associada às atividades de compressão nos Andes, parte dele foi capturado pelo rio Paraguai (Assine, 2004 citado por Menezes et al., 2008). Essa captura de cabeceira permitiu que parte da população ancestral de S. brasiliensis tenha geodispersado do Alto rio Paraná para o Alto rio Paraguai. Posteriormente, o ancestral se espalhou por todo rio Paraguai, alcançando a bacia do rio Uruguai. A estimativa de tempo dessa captura de cabeceira foi de 2.5 Ma, tempo muito superior a divergência entre as linhagens estimada por nós. A primeira cladogênese entre as linhagens de S. hilarii resulta na divergência entre as linhagens do São Francisco e Alto Paraná (nó 8, Fig. 4). O MRCA das linhagens provavelmente estava presente na bacia do Alto Paraná, quando, há 1.35 Ma (95% HPD Ma), ocorreu um evento de geodispersão para a bacia do São Francisco. O processo de diversificação entre as linhagens simpátricas de S. hilarii (nó 9) não é claro. Elas poderiam ter vivenciado uma especiação simpátrica ou alopátrica dentro da bacia seguida por um contato secundário. Entretanto, esse cenário, indicado pela árvore de espécie, é diferente do que foi observado com os genes mitocondriais e por Machado et al. (no prelo): uma linhagem do São Francisco (denominada SF1 na análise ABC) é irmã do clado formado pelas linhagens do Alto rio Paraná e outra do rio São Francisco (SF2). Essa mudança nas relações entre as linhagens acarretaria em uma interpretação alternativa: o MRCA das linhagens de S. hilarii estaria presente na bacia do São Francisco (e não na bacia do Alto rio Paraná), quando houve uma captura de cabeceiras por parte do Alto rio Paraná. Essas duas populações acumularam diferenças e formaram duas linhagens: SF1 e (SF2+Alto Paraná). Um segundo evento de captura, agora por parte do Alto São Francisco, separou as linhagens SF2 e Alto rio Paraná. Essas especulações serão discutidas a seguir.

121 118 Approximate Bayesian Computation e teste de hipóteses biogeográficas Em geral, estudos filogeográficos da ictiofauna neotropical envolvem estimativas de tempos de divergências com a posterior correlação dos resultados com eventos geoclimáticos conhecidos, conforme realizado no tópico anterior. Entretanto, devido à complexidade de eventos envolvidos, padrões biogeográficos similares podem surgir de distintos processos de diversificação (Moritz et al., 2000). Por isso a importância de incorporar inferências estatísticas para testar hipóteses alternativas. Entre os poucos estudos utilizando essa abordagem em peixes de água doce da América do Sul, destacamse a reconstrução de potenciais rotas de colonização histórica para a espécie Aplochiton zebra (Vanhaecke et al., 2015); a elucidação da performance dos distintos padrões de divergência gerados por marcadores nucleares e mitocondrial entre as linhagens de Cichla temensis (Willis et al., 2015); e a identificação dos eventos de geodispersão que promoveram a diversificação em peixes da família Pimelodidae no oeste amazônico (Tagliacollo et al., 2015). O nosso estudo é o primeiro a empregar abordagem bayesiana baseada em modelos para testar cenários biogeográficos alternativos potencialmente responsáveis pelo processo de diversificação de peixes dulcícolas Neotropicais. As simulações das hipóteses biogeográficas suportaram o cenário de vicariância para as linhagens de S. brasiliensis, bem como entre S. sp. Amazonas e S. sp. Araguaia, enquanto geodispersão foi o evento responsável pela diversificação nas linhagens de S. hilarii. O cenário escolhido para cada espécie apresentou o valor mais alto de probabilidade posterior sem sobreposição de intervalos de confiança com os demais cenários, correspondência entre estatísticas sumárias para os dados simulados e dado observado (resultado não mostrado), e baixas taxas de erro do tipo II para o cenário vencedor. Essas características indicam robustez na escolha do cenário (Cornuet et al., 2010). Apesar do erro do tipo I ter sido elevado, isto é, a probabilidade que os dados simulados sob um cenário vencedor serem incorretamente

122 119 atribuídos a outro cenário, isso não se configurou um problema. Segundo Bertorelle et al. (2010), as estimativas de erros precisam ser cautelosamente analisadas, pois não representam a estatística frequentista clássica. Isso significa que um único pseudodado simulado suporta o cenário, se a probabilidade posterior dele for maior que os demais. Portanto, estimativas de erros com baixos valores representam uma ferramenta poderosa para o suporte do cenário escolhido. Porém, quando são elevadas precisam ser associadas a informações adicionais que darão acurácia e poder à análise, como por exemplo, a não sobreposição entre os intervalos de confiança das probabilidades posteriores dos cenários (Bertorelle et al., 2010). Apenas em S. hilarii, observamos parâmetros estimados com altos valores de RMAE: tamanho da população fundadora (NAPf 0.835) e tamanho populacional da linhagem 2 da bacia do rio São Francisco (NSF ). Essa baixa precisão do parâmetro para a população fundadora (NAPf) é comum em cenários com bottlenecks (Inoue et al., 2015). Cornuet et al. (2010) avaliaram que a qualidade das estimativas dos parâmetros pode ser melhorada substancialmente se marcadores apropriados e aumento de amostragem forem realizados. Por se tratar de parâmetros não utilizados no presente trabalho, esse resultado não afeta nossa avaliação sobre a distinção entre os eventos promotores de diversificação. Tanto para S. brasiliensis quanto para S. sp. Amazonas e S. sp. Araguaia dois distintos cenários foram apresentados previamente como prováveis responsáveis por promoverem as suas diversificações. A análise ABC permitiu distinguir entre eles o mais provável. A reconstrução demográfica de S. sp. Araguaia e S. sp. Amazonas reforçou que o cenário de vicariância foi o processo que resultou na diversificação entre ambas. De acordo com as análises no DIYABC, uma população ancestral sofreu uma divisão há 2.36 Ma. Ao compararmos com os resultados do *BEAST, observamos que essas estimativas de tempo de divergência são muito próximas e apresentam sobreposição em seus intervalos de confiança (2.7 Ma Fig. 4 e Tabela 2). Portanto, a separação entre ambas está relacionada a um evento

123 120 vicariante que coincide temporalmente com o rompimento da conexão entre as paleobacias do Amazonas e TocantinsAraguaia. A espécie S. brasiliensis também apresentou o cenário de vicariância entre as linhagens do Alto Paraná e PUL como o mais provável promotor de diversificação entre elas. Segundo o cenário escolhido, a população ancestral sofreu uma quebra há aproximadamente 0.89 Ma, tempo próximo ao recuperado pela árvore de espécie (0.36 Ma Fig. 4). Conforme discutido no tópico anterior, o evento vicariante foi o surgimento de Sete Quedas, que separou o Alto rio Paraná das demais bacias hidrográficas. Por outro lado, para S. hilarii não havia dúvida com relação a qual evento gerou a diversificação das linhagens, o problema residia em como ocorreu esse evento. Na análise no DIYABC, o cenário mais provável revela o sistema hidrográfico do rio São Francisco como a baciafonte do evento de captura de cabeceira, e não o Alto rio Paraná, conforme observado na árvore de espécie (Fig. 4). Provavelmente, essa é a razão pela qual a probabilidade posterior do nó 9 não apresenta suporte adequado (0.90 Fig. 4). O cenário reconstruído recuperou que parte da linhagem do São Francisco (SF1) geodispersou para a bacia do Alto rio Paraná há 1.95 Ma, tempo próximo à geodispersão calculada pelo *BEAST entre as duas bacias (1.36 Ma, Fig. 4). Como o desenho dos cenários foi baseado na árvore de espécie, nós não empregamos o parafiletismo das linhagens do São Francisco, observado apenas em marcadores mitocondriais, para ser testado no DIYABC. O tempo de divergência entre as linhagens simpátricas foi o mesmo para as duas análises. Diante dos resultados nós confirmamos que a abordagem ABC baseada em modelos pode ser particularmente informativa para estudos envolvendo testes de hipóteses biogeográficas para a ictiofauna dulcícola neotropical. Através desta análise, nós reconstruímos e fomos capazes de distinguir as assinaturas filogeográficas dos dois principais eventos, vicariância e geodispersão, promotores de diversificação de peixes neotropicais. A

124 121 hipótese hidrogeológica apresenta como assinatura um evento fundador na área colonizada, representando o evento de geodispersão. Ao contrário, a hipótese paleogeográfica não apresenta esse efeito fundador nem a identidade da baciafonte. Os resultados obtidos tanto pela filogeografia tradicional (estimativas de tempo de divergência associados a eventos históricos) quanto pela abordagem baseada em modelos foram similares. Isto sugere confiança e robustez do cenário biogeográfico responsável por modelar a atual estrutura filogeográfica de S. brasiliensis, S. hilarii e S. sp. Araguaia e S. sp. Amazonas. De maneira geral, os eventos de vicariância e geodispersão foram as responsáveis pela diversificação das espécies do gênero Salminus. AGRADECIMENTOS Agradecemos especialmente a Dr. Jorge Ramirez, Universidade Federal de São Carlos, e Msc. Ivan Prates, City University of New York, pelas discussões proveitosas e conselhos na implementação do *BEAST. Esta pesquisa foi subsidiada pelo BrBOL (Brazilian Barcode of Life), CAPES (Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior), FAPESP (Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo) e CNPq (Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico). A pesquisa está em concordância com as leis brasileiras, sendo aprovada pelo Comissão de Ética no Uso de Animais da Universidade Federal de São Carlos (CEUA número ) e sob uma licença temporária de coleta com fins científicos de número providenciado por ICMBioSISBIO.

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136 133 Vanhaecke, D., Garcia de Leaniz, C., Gajardo, G., Dunham, J., Giannico, G., & Consuegra, S. (2015) Genetic signatures of historical dispersal of fish threatened by biological invasions: the case of galaxiids in South America. Journal of Biogeography, 42 (10), Villela, F.N.J. & Nogueira, C. (2011) Geologia e geomorfologia da estação ecológica Serra Geral do Tocantins. Biota Neotropica, 11 (1), ia,., ie, Z., Salemi, M., Chen, L. & Wang, Y. (2003) An index of substitution saturation and its application. Molecular Phylogenetics and Evolution, 26, 17. Yu, Y., Harris, A.J., Blair, C. & He,. (2013) RASP (Reconstruction Ancestral State in Phylogenies): a tool for historical biogeography. Molecular Phylogenetics and Evolution, 87, Wagenmakers, E.J. & Farrel, S. (2004) AIC model selection using Akaike weights. Psychonomic Bulletin & Review, 11 (1), Weir, J.T. (2006) Divergent timing and patterns of species accumulation in lowland and highland neotropical birds. Evolution, 60 (4), Willis, S.C., Winemiller, K.O., Montaña, C.G., Macrander, J., Reiss, P., Farias, I.P. & Ortí, G. (2015) Population genetics of the speckled peacock bass (Cichla temensis), South America s most important inland sport fishery. Conservation Genetics, 16,

137 134 Biosketch: Carolina Machado está desenvolvendo seu Doutorado em Genética Evolutiva e Biologia Molecular, na Universidade Federal de São Carlos,. Atualmente, direciona seus estudos na filogenia e filogeografia de peixes neotropicais dulcícolas, com o objetivo de conhecer os processos históricos e/ou ecológicos responsáveis pelo atual padrão de distribuição da ictiofauna sulamericana. Ana Carnaval é professora assistente da City University of New York e pesquisadora associada do American Museum of Natural History, em Nova Iorque, EUA. Desenvolve pesquisas relacionadas aos processos evolutivos e ecológicos responsáveis pela origem e manutenção da biodiversidade, com o objetivo de melhorar a predição e conservação da região Tropical. Pedro Galetti é professor titular da Universidade Federal de São Carlos,. Sua pesquisa está focada na genética da conservação, envolvendo animais aquáticos e terrestres. Estudos relacionados à genética forense, sistemática, taxonomia, filogenia e filogeografia também fazem parte do seu escopo de pesquisa. Contribuição dos autores: C. B. M. S., A. C. C. e P. M. G. J. concebeu as ideias; C. B. M. S. coletou e analisou os dados; C. B. M. S. liderou a escrita; e, A. C. C. e P. M. G. J. revisou o manuscrito.

138 TABELAS E FIGURAS Tabela 1 Probabilidades posteriores de cada cenário estimada usando DIYABC. A maior probabilidade está em negrito. Probabilidade posterior (95% HPD) Salminus brasiliensis Cenário 1 Bacias do Alto Paraná e PUL divergem da população ancestral (vicariância) ( ) Cenário 2 Bacia PUL* captura parte da bacia do Alto Paraná (geodispersão) ( ) Cenário 3 Alto Paraná captura parte do PUL (geodispersão) ( ) Cenário vencedor Salminus sp. Amazonas e Salminus sp. Araguaia Cenário 1 Vicariância ( ) Cenário 2 Bacia TocantinsAraguaia captura parte da bacia Amazonas (geodispersão) ( ) Cenário 3 Bacia Amazonas captura parte da bacia TocantinsAraguaia (geodispersão) ( ) Salminus hilarii Round 2 Cenário 1 Bacias Alto Paraná e São Francisco (SF2) divergem da população ancestral (vicariância) ( ) Cenário 2 Bacia Alto Paraná captura parte da Bacia São Francisco (SF1) (geodispersão) ( ) Cenário 3 Bacia São Francisco (SF2) captura parte da bacia Alto Paraná (geodispersão) ( ) * PUL: Sigla que designa as bacias Paraguai, Uruguai e Lagoa dos Patos. 135

139 Tabela 2 Valores posteriores dos parâmetros para os cenários com alta probabilidade (Vencedores). A unidade de tempo, contada em geração, foi convertida em 10 6 anos antes do presente (Ma), baseada na média do tempo de geração de 2 anos (De Godoy 1975). Estimativa posterior dos parâmetros Parâmetros Mediana 95% HPD RMAE Salminus brasiliensis Tamanho efetivo da linhagem PUL NPUL Tamanho efetivo da linhagem Alto Paraná NAP Tamanho efetivo da população ancestral Na Tempo de divergência entre as linhagens PUL e Alto Paraná t Ma Ma Salminus sp. Amazonas e Salminus sp. Araguaia Tamanho efetivo da espécie Araguaia NToA Tamanho efetivo da espécie Amazonas NAm Tamanho efetivo da população ancestral Na Tempo de divergência entre as espécies Araguaia e Amazonas t Ma Ma Salminus hilarii Tamanho efetivo da linhagem São Francisco (SF1) NSF Tamanho efetivo da linhagem São Francisco (SF2) NSF Tamanho efetivo da linhagem Alto Paraná NAP Tamanho efetivo da população fundadora do Alto Paraná NAPf Tempo de divergência entre as linhagens São Francisco (SF1) e São Francisco (SF2) ts Ma Ma Tempo de expansão da população após o evento fundador t Ma Ma Tempo do evento fundador entre as linhagens do São Francisco e Alto Paraná t Ma Ma RMAE: média relativa do erro absoluto. 136

140 137 Figura 1. Reconstrução dos cenários evolutivos para testar as hipóteses Paleogeográfica e Hidrogeológica. (1) Hipótese Paleogeográfica apresenta uma assinatura de vicariância. Neste cenário, nós assumimos uma população ancestral, com tamanho efetivo Na, que no tempo t3 sofre uma divisão e duas novas populações são formadas com tamanho efetivo menor que o Na (N1 e N2). (2) Hipótese Hidrogeológica tem uma assinatura de geodispersão. Nós assumimos um pequeno número de fundadores (N1f ou N2f, onde f significa fundador), originado a partir de uma baciafonte, que coloniza uma bacia adjacente após o evento de captura em t3, seguida por uma expansão populacional em t1.

141 138 Figura 2. Locais de coleta de Salminus. Salminus affinis ( ), Salminus brasiliensis ( ), Salminus franciscanus ( ), Salminus hilarii ( ), Salminus sp. Amazonas ( ) e Salminus sp. Araguaia ( ).

142 139 Figura 3. Cenários evolutivos testados através da análise ABC no DIYABC. Em (a) S. brasiliensis, (b) S. sp. Araguaia e S. sp. Amazonas e (c) S. hilarii. Cores representam as bacias hidrográficas onde as amostras foram coletadas (Fig. 2).

143 140 Figura 4. Análise filogenética bayesiana e estimativa de tempo de divergência no BEAST v1.8.1 empregando dois marcadores mitocondriais (COI e CytB) e dois nucleares (RAG2 e S7). Nós usamos um evento biogeográfico para a calibração da topologia (círculo vermelho). Números abaixo dos nós representam as estimativas de tempo de divergência, enquanto os números acima representam a probabilidade posterior. Barras azuis representam 95% HPD dos tempos estimados.

144 141 MATERIAL SUPLEMENTAR Figura S1. Primeira rodada dos cenários evolutivos testados para S. hilarii usando o DIYABC. (a) cenário de vicariância, (b) cenário de geodispersão com o Alto rio Paraná como baciafonte, e (c) geodispersão de cabeceira com o rio São Francisco como baciafonte.

145 142

146 143 Figura S2: Filogenias gênicas recuperadas através da análise bayesiana, realizadas no BEAST, para o gênero Salminus. (a) COI; (b) Cytb; (c) RAG2 e (d) íntron S7. A barra de escala representa a estimativa de substituição por sítio. Números acima dos nós indicam as probabilidades posteriores (>0.90). O grupo externo foi retirado da ilustração. Figura S3: Estimativa de áreas ancestrais para as espécies de Salminus de acordo com o modelo biogeográfico mais provável (DIVALIKEj) calculado a partir do BioGeoBEARS. As setas indicam prováveis eventos de geodispersão, hipotetizados a partir da correlação com dados geológicos conhecidos.

147 Tabela S1: Locais de coleta de Salminus na América do Sul e número de acesso do Genbank. Espécie/ Amostra Salminus affinis SA_005 Magdalena SA_008 Magdalena SA_009 Magdalena SA_019 Magdalena SA_020 Magdalena SA_021 Magdalena Salminus brasiliensis SB_016 SB_069* SB_174* SB_199* SB_208 SB_263* SB_284 SB_294* SB_326* SB_329* SB_339* SB_356* SB_371* SB_372* SB_373 SB_378 Rio Bacia hidrográfica País Latitude Longitude Número de acesso do Genbank Miranda Cuiabá Jaurú Paraguai Paraguai MogiGuaçu MogiGuaçu MogiGuaçu Caí Jacuí Ibicuí da Amada Turvo Grande Grande Turvo Tiête Magdalena Magdalena Magdalena Magdalena Magdalena Magdalena Paraguai Paraguai Paraguai Paraguai Paraguai Alto rio Paraná Alto rio Paraná Alto rio Paraná Lagoa dos Patos Lagoa dos Patos Uruguai Alto rio Paraná Alto rio Paraná Alto rio Paraná Alto rio Paraná Alto rio Paraná Colômbia Colômbia Colômbia Colômbia Colômbia Colômbia COI Cytb Dloop RAG2 S7 KT KP KP KP

148 SB_396 SB_409 SB_426* SB_436* SB_437* SB_458 SB_498* SB_517 SB_537 SB_571* SB_574 SB_576* SB_577* SB_P70* SB_T123 SB_Y2* SB_Y4* SB_Y8* SB_L08* SB_L10* SB_L27 SB_L40 JacaréPepira Paranapanema Paranapanema Paranapanema Tietê Paranapanema Paraná Paraná Paraná Sepotuba Paraná Uruguai Piracicaba Uruguai Uruguai Uruguai Uruguai Uruguai Ligeiro Ligeiro Ligeiro Ligeiro Salminus franciscanus SF_005 SF_007 SF_016 SF_035 SF_104 SF_116 Salminus hilarii São Francisco São Francisco São Francisco São Francisco São Francisco São Francisco Alto rio Paraná Alto rio Paraná Alto rio Paraná Alto rio Paraná Alto rio Paraná Alto rio Paraná Alto rio Paraná Alto rio Paraná Alto rio Paraná Paraguai Alto rio Paraná Uruguai Alto Paraná Uruguai Uruguai Uruguai Uruguai Uruguai Uruguai Uruguai Uruguai Uruguai São Francisco São Francisco São Francisco São Francisco São Francisco São Francisco KF KF KF KF KF KF KF KP KP KP KP KP KP

149 SH_002* SH_003* SH_004* SH_007 SH_008* SH_009* SH_010* SH_018* SH_022* SH_025 SH_026 SH_042 SH_045* SH_051 SH_054 SH_061* SH_068 SH_069 SH_070 SH_074* SH_076* SH_078 SH_079* SH_082* SH_088 SH_091 SH_095 SH_100 SH_104* SH_118* SH_151* São Francisco São Francisco São Francisco São Francisco São Francisco Peixe Samburá Samburá Peixe Peixe Peixe Samburá São Francisco Piumhi Piumhi MogiGuaçu Turvo Turvo Cachoeirinha Ponte Nova Ponte Nova Ponte Nova Turvo Turvo Cubatão Cubatão JacaréPepira JacaréPepira QuebraAnzol Batalha Carmo São Francisco São Francisco São Francisco São Francisco São Francisco São Francisco São Francisco São Francisco São Francisco São Francisco São Francisco São Francisco São Francisco São Francisco São Francisco Alto rio Paraná Alto rio Paraná Alto rio Paraná Alto rio Paraná Alto rio Paraná Alto rio Paraná Alto rio Paraná Alto rio Paraná Alto rio Paraná Alto rio Paraná Alto rio Paraná Alto rio Paraná Alto rio Paraná Alto rio Paraná Alto rio Paraná Alto rio Paraná , KF KF KP KP KP KT KP KP

150 SH_160* Lagoa de Inhuma São Francisco KT Salminus sp. Amazonas SI_015* SI_017* SI_019* SI_020* SI_024* SI_025* SI_026* Madeira Madeira Orteguaza Orteguaza Amazonas Amazonas Amazonas Amazonas Amazonas Amazonas Amazonas Amazonas Amazonas Amazonas Colômbia Colômbia Peru Peru Peru KP KP KP KP KP Salminus sp. Araguaia SI_002* SI_005* SI_010* SI_012* SI_014* Brycon sp. B_15 B_16 Araguaia Araguaia Araguaia Araguaia Araguaia TocantinsAraguaia TocantinsAraguaia TocantinsAraguaia TocantinsAraguaia TocantinsAraguaia Araguaia Araguaia TocantinsAraguaia TocantinsAraguaia *Espécimes empregados na análise DIYABC : representam as sequências que ainda necessitam ser submetidas ao Genbank KP KP

151 Tabela S2: Sequências dos primers empregados neste estudo e a temperatura de anelamento utilizada na PCR. Marcador COI Nome do primer FISHF1 FISHR1 Sequência do primer Referência Temperatura de anelamento 5 TCAACCAACCACAAAGACATTGGCAC 3 Ward et al o C 5 TAGACTTCTGGGTGGCCAAAGAATCA 3 CytB AnosCytBF AnosCytBR 5 AAYATCTCYGCATGATGAAA 3 5 TCTTCGGATTACAAGACCG 3 Ramirez & Galetti o C Dloop DloopL H AGAGCGTCGGTCTTGTAAACC 3 5 CCTGAAGTAGGAACCAGATG 3 Cronin et al Meyer et al o C RAG2 1 st Round RAG2 2 nd Round RAG2_164F RAG2_R6 RAG2_176R RAG2Ri 5 AGCTCAAGCTGCGYGCCAT 3 5 TGRTCCARGCAGAAGTACTTG 3 5 GYGCCATCTCATTCTCCAACA 3 5 AGAACAAAAGATCATTGCTGGTCGGG 3 Oliveira et al o C (Ambas PCRs) S7 S7RPE1F S7RPE2R 5 TGGCCTCTTCCTTGGCCGTC 3 5 AACTCGTCTGGCTTTTCGCC 3 Chow & Hazama o C Referência Chow, S. & Hazama, K. (1998) Universal PCR primers for S7 ribosomal protein gene introns in fish. Molecular Ecology, 7, Cronin, M. A., Spearman, W. J., Wilmot, R.L., Patton, J. C. & Bickham, J. W. (1993) Mitochondrial DNA variation in chinook Oncorhynchus tshawytscha) and chum salmon (O. keta) detected by restriction enzyme analysis of Polymerase Chain Reaction (PCR) products. Canadian Journal of Fisheries and Aquatic Sciences, 50, Meyer, A., Kocher, T. D., Basasibwaki P. & Wilson, A. C. (1990) Monophyletic origin of Victoria cichlid fish suggested by mitochondrial DNA sequences. Nature, 347 (6293),

152 Oliveira, C., Avelino, G. S., Abe, K. T., Mariguela, T. C., Benine, R. C., Ortí, G., Vari, R. P. & Castro, R. M. C. (2011) Phylogenetic relationships within the speciose Family Characidae (Teleostei: Ostariophysi: Characiformes) based on multilocus analysis and extensive ingroup sampling. BMC Evolutionary Biology, 11, 275. Ramirez, J. L. & Galetii Jr., P. M. (2015) DNA Barcode and evolutionary relationship within Laemolyta Cope 1872 (Characiformes: Anostomidae) through molecular analyses. Molecular Phylogenetics and Evolution, 93, Ward, R. D., Zemlak, T.S., Innes, B. H., Last, P. R. & Hebert, P. D. N. (2005) DNA barcoding Australia s fish species. Philosophical Transactions of the Royal Society Biological Sciences, 360, Tabela S3 Probabilidade posterior bayesiana estimada usando DIYABC para cada cenário (Rodada 1 Salminus hilarii). Salminus hilarii Probabilidade posterior (95% HPD) Rodada 1 Geodispersão (São Francisco é a baciafonte) Cenário 1 Bacia Alto Paraná captura parte da bacia São Franciso (SF1) ( ) Cenário 2 Bacia Alto Paraná captura parte da bacia São Franciso (SF2) ( ) Geodispersão (Alto Paraná é a baciafonte) Cenário 1 Bacia São Francisco (SF1) captura parte da bacia Alto Paraná ( ) Cenário 2 Bacia São Francisco (SF2) captura parte da bacia Alto Paraná ( ) Vicariância Cenário 1 Bacia Alto Paraná e bacia São Francisco (SF1) divergem da população ancestral ( ) Cenário 2 Bacia Alto Paraná e bacia São Francisco (SF2) divergem da população ancestral ( ) 149

153 Tabela S4: Distribuição a priori dos parâmetros para cada cenário (Fig. 3). Parâmetros Distribuição dos priors Salminus brasiliensis Tamanho efetivo da linhagem PUL NPUL Uniforme (10 4, 10 6 ) Tamanho efetivo da linhagem Alto Paraná NAP Uniforme (10 4, 10 6 ) Tamanho efetivo da população ancestral Na Uniforme (10 5, 10 6 ) Tamanho efetivo da população fundadora da linhagem PUL NPULf Loguniforme (10 2, 10 4 ) Tamanho efetivo da população fundadora da linhagem Alto Paraná NAPf Loguniforme (10 2, 10 4 ) Tempo da expansão populacional após o evento fundador t1 Uniforme (4x10 5, 6x10 5 ) Tempo de divergência (cenário de vicariância) ou do evento fundador (cenário de geodispersão) entre as linhagens PUL e Alto Paraná t3 Uniforme (4x10 5, 5x10 5 ) Salminus sp. Amazonas e Salminus sp. Araguaia Tamanho efetivo da espécie Araguaia NToA Uniforme (10 4, 10 6 ) Tamanho efetivo da espécie Amazonas NAm Uniforme (10 4, 10 6 ) Tamanho efetivo da população ancestral Na Uniforme (10 5, 10 6 ) Tamanho efetivo da população fundadora da espécie Araguaia NToAf Loguniforme (10 2, 10 4 ) Tamanho efetivo da população fundadora da espécie Amazonas NAmf Loguniforme (10 2, 10 4 ) Tempo da expansão populacional após o evento fundador t1 Uniforme (5x10 5, 2x10 6 ) Tempo de divergência (cenário de vicariância) ou do evento fundador (cenário de geodispersão) entre as espécies Salminus sp. Araguaia e Salminus sp. Amazonas t3 Uniforme (5x10 5, 2.5x10 6 ) Salminus hilarii Primeira rodada São Francisco é a baciafonte (evento de geodispersão) Tamanho efetivo da linhagem São Francisco_1 NSF1 Uniforme (10 4, 10 6 ) Tamanho efetivo da linhagem São Francisco_2 NSF2 Uniforme (10 4, 10 6 ) 150

154 Tamanho efetivo da linhagem Alto Paraná NAP Uniforme (10 4, 10 6 ) Tamanho efetivo da população fundadora da linhagem Alto Paraná NAPf Loguniforme (10 2, 10 4 ) Tempo de divergência entre as linhagens São Francisco_1 e São Francisco_2 ts Uniforme (4x10 4, 6x10 5 ) Tempo da expansão populacional após o evento fundador t1 Uniforme (3x10 5, 1.4x10 6 ) Tempo do evento fundador da linhagem do Alto Paraná t3 Uniforme (3x10 5, 1.8x10 6 ) Alto Paraná é a baciafonte (evento de geodispersão) Tamanho efetivo da linhagem São Francisco_1 NSF1 Uniforme (10 4, 10 6 ) Tamanho efetivo da linhagem São Francisco_2 NSF2 Uniforme (10 4, 10 6 ) Tamanho efetivo da linhagem Alto Paraná NAP Uniforme (10 4, 10 6 ) Tamanho efetivo da população fundadora da linhagem São Francisco (São Francisco_1) NSF1f Loguniforme (10 2, 10 4 ) Tamanho efetivo da população fundadora da linhagem São Francisco (São Francisco_2) NSF2f Loguniforme (10 2, 10 4 ) Tempo de divergência entre as linhagens São Francisco_1 e São Francisco_2 ts Uniforme (4x10 4, 6x10 5 ) Tempo da expansão populacional após o evento fundador t1 Uniforme (3x10 5, 1.4x10 6 ) Tempo do evento fundador da linhagem do São Francisco t3 Uniforme (3x10 5, 1.8x10 6 ) Evento de vicariância Tamanho efetivo da linhagem São Francisco_1 NSF1 Uniforme (10 4, 10 6 ) Tamanho efetivo da linhagem São Francisco_2 NSF2 Uniforme (10 4, 10 6 ) Tamanho efetivo da linhagem Alto Paraná NAP Uniforme (10 4, 10 6 ) Tamanho efetivo da população ancestral Tempo de divergência entre as linhagens São Francisco_1 e São Francisco_2 Na ts Uniforme (10 5, 10 6 ) Uniforme (4x10 4, 6x10 5 ) Tempo de divergência entre as linhagens do Alto Paraná e São Francisco t3 Uniforme (3x10 5, 1.8x10 6 ) Segunda rodada Tamanho efetivo da linhagem São Francisco_1 NSF1 Uniforme (10 4, 10 6 ) Tamanho efetivo da linhagem São Francisco_2 NSF2 Uniforme (10 4, 10 6 ) Tamanho efetivo da linhagem Alto Paraná NAP Uniforme (10 4, 10 6 ) 151

155 Tamanho efetivo da população ancestral Na Uniforme (10 5, 10 6 ) Tamanho efetivo da população fundadora da linhagem São Francisco (São Francisco_2) NSF2f Loguniforme (10 2, 10 4 ) Tamanho efetivo da população fundadora da linhagem Alto Paraná NAPf Loguniforme (10 2, 10 4 ) Tempo de divergência entre as linhagens São Francisco_1 e São Francisco_2 ts Uniforme (4x10 4, 6x10 5 ) Tempo da expansão populacional após o evento fundador t1 Uniforme (3x10 5, 1.4x10 6 ) Tempo de divergência (cenário de vicariância) ou do evento fundador (cenário de geodispersão) entre as linhagens Alto Paraná e São Francisco t3 Uniforme (3x10 5, 1.8x10 6 ) Média da taxa de mutação por geração para marcadores nucleares Média da taxa de mutação por geração para marcadores mitocondriais N: tamanho populacional efetivo; t: tempo em gerações; f: fundador; µ: média da taxa de mutação µn µm Uniforme (10 9, 10 8 ) Uniforme (10 8, 10 7 ) Tabela S5 Taxas de erro tipo I e tipo II estimadas para cada cenário vencedor de cada espécie usando DIYABC. Espécie Cenário vencedor Taxa do erro tipo II Taxa do erro tipo I Cenário 1 Cenário 2 Cenário 3 S. brasiliensis Cenário 1 9.4% 9.4% 39.8% S. sp. Amazonas e S. sp. Araguaia Cenário % 28% 51.2% S. hilarii Cenário % 25.8% 45.6% 152

156 Considerações finais O presente estudo concentrouse em lacunas de informações do gênero Salminus que estavam associadas às questões taxonômicas, filogenéticas e filogeográficas. Além de gerar informações científicas sobre o gênero, o nosso propósito foi proporcionar subsídios técnicocientíficos eficazes para auxiliar no status de conservação das populações de Salminus e, adicionalmente, compreender os processos evolutivos responsáveis pela diversificação dos peixes Neotropicais. Os resultados apresentados em ambos os capítulos suportam a ideia de que a ictiofauna dulcícola neotropical ainda é subestimada, principalmente devido à presença de diversidade críptica (PEREIRA et al., 2011; PEREIRA et al., 2013). Segundo Reis et al. (2016) o número real de espécies da região pode alcançar 9100, número duas vezes maior do que o atualmente estimado. Essa subestimação é um desafio para programas de conservação, uma vez que identificação da biodiversidade representa o ponto de partida para todos os estudos básicos ou aplicados relacionados à sua avaliação e gestão. Para Salminus, por exemplo, apesar do severo declínio populacional (AGOSTINHO, 1999; SATO; GODINHO, 2003), a falta de clareza na delimitação das espécies e até de unidades evolutivas significativas (UES) provavelmente conduziu suas ausências nas listas de espécies ameaçadas. Por isso, há uma real necessidade em acelerar e simplificar o processo de identificação e delimitação das espécies. Conforme demonstrado, o emprego de marcadores moleculares representa uma ferramenta promissora para uma rápida e correta identificação de espécimes, sinalizar espécies com prováveis problemas taxonômicos, além de ser uma abordagem eficaz para revelar a diversidade críptica. Nós observamos que S. brasiliensis e S. hilarii apresentam linhagens mitocondriais (COI e CytB) divergentes que estão estruturadas geograficamente. Essas linhagens divergentes estão localizadas nas mesmas bacias hidrográficas onde foram descritas variações morfológicas intraespecíficas (LIMA, 2006; ROSSO et al., 2012; SHIBATTA; GARAVELLO, 1993). S. hilarii da bacia do Alto rio Paraná e rio São Francisco é uma unidade molecular distinta daquela encontrada na bacia do TocantinsAraguaia e Amazonas. Em sua tese, Lima (2006) propõe ressuscitar o nome Salminus iquitiensis (Nakashima, 1941) para designar espécimes, erroneamente denominados de S. hilarii, provenientes das bacias do Amazonas, TocantinsAraguaia e Orinoco. A razão reside em um carácter sinapomórfico desses espécimes: numerosas e pequenas listras discretas escuras longitudinais, concentradas na porção média e central da nadadeira caudal. A metodologia de DNA barcoding corrobora essa afirmação e a filogenia e filogeografia do gênero reforçam que, de fato, são unidades que

157 154 evoluíram independentemente e não apresentam ancestral comum mais recente que as conectem diretamente. Ainda com relação à S. iquitensis, baseado em nossos dados, propomos que, uma vez validado o nome, este seja empregado apenas para os espécimes da bacia do Amazonas (local do holótipo). Espécimes da bacia do TocantinsAraguaia devem ser descrito. A variação morfológica entre espécimes das duas bacias suporta nossa proposta. Espécimes do TocantinsAraguaia, apresentam corpo mais alto e número menor tanto de escamas na linha lateral (contados a partir da nadadeira dorsal até a linha lateral) quanto de raios ramificados na nadadeira anal quando comparados com os espécimes do Alto Amazonas (LIMA, 2006). Futuras análises precisam ser realizadas levando em consideração a amostragem do Orinoco para identificar a qual dos grupos os espécimes dessa bacia pertencem. Portanto, baseado em dados moleculares e polimorfismos morfológicos nas bacias, sugerimos duas novas espécies para o gênero, denominadas aqui de S. sp. Amazonas, que deve ser considerada como S. iquitensis, e S. sp. Araguaia, que quando descrita deverá ser denominada diferentemente da anterior. Para a espécie S. brasiliensis, apesar de existirem contradições sobre sua unicidade como espécie (LIMA et al., 2003; ROSSO et al., 2012), a análise multiloci suporta a monofilia da espécie. Portanto, por hora, apesar da possibilidade do único nuclear informativo para essa questão represente uma questão de ILS, apoiaremos a hipótese que S. brasiliensis é constituído por uma única unidade taxonômica e que as linhagens, identificadas como Alto rio Paraná e PUL, sejam consideradas UES. Inclusive, essa abordagem sugere precaução na utilização da metodologia de DNA barcoding, que não deve ser a única ferramenta de delimitação de espécies. A metodologia sinaliza prováveis incongruências que devem ser melhor investigadas. No presente trabalho, a associação com outros marcadores independentes nos permitiu uma resposta mais acurada acerca do status de S. brasiliensis. Também adotamos essa posição mais conservadora para as linhagens de S. hilarii do Alto rio Paraná e rio São Francisco. Apesar de Shibatta e Garavello (1993) apoiarem que ambas sejam consideradas espécies distintas, nós sugerimos que seja mantida como uma única unidade. Esse posicionamento também é decorrente da divergência entre as unidades sugeridas pelo DNA barcoding e análise multiloci. Portanto, baseada na análise multiloci e no emprego do conceito filogenético de espécie, propomos um novo cenário taxonômico para Salminus. O gênero passaria a ser constituído por seis espécies (Apêndice 1): S. affinis, S. franciscanus, S. brasiliensis, S. hilarii, S. sp. Amazonas (=S. iquitensis) e S. sp. Araguaia. Para conservação, conforme

158 155 mencionado, uma clara designação das espécies por si só já acarreta em uma informação valiosa. Como essas espécies estão localizadas em uma única bacia hidrográfica (exceto S. brasiliensis e S. hilarii), cada bacia passa ser avaliada como uma unidade biogeográfica importante para a manutenção dos processos que sustentam a permanência das espécies. Segundo Moritz (2002), os maiores desafios para o estabelecimento de estratégias conservacionistas é compreender que mudanças dos habitats são inevitáveis e que os conflitos entre manter a diversidade biológica e as necessidades das sociedades humanas são comuns e precisam ser reconciliadas com o mínimo de impacto para ambas. Sabendo disso, é utópico acreditar que espécies com importância econômica como os Salminus, consideradas recursos pesqueiros e não como biodiversidade aquática, perante a legislação 7, tenham medidas protetivas ideais, como suspensão da pesca comercial e esportiva e preservação do habitat onde vivem. Por isso, tentando buscar alternativas mais realísticas propomos uma análise genéticopopulacional das espécies presentes em uma única bacia hidrográfica, para avaliar a presença ou não de estruturação da diversidade genética. Em caso afirmativo, devese desenvolver estratégias de manejo entre espécimes do mesmo grupo genético, a fim de evitar depressão exogâmica e manter a diversidade genética da espécie (MORITZ, 2002). Para S. brasiliensis e S. hilarii que apresentam uma ampla distribuição e que UES foram identificadas, o manejo entre bacias também deve ser evitado, pela mesma razão discutida anteriormente. Essa proposta é simples, porém importante, porque em praticamente todas as grandes bacias hidrográficas brasileiras há o empreendedorismo hidrelétrico e uma das práticas comuns de mitigação de impactos ambientais é o repovoamento para recuperar os estoques pesqueiros. Portanto, as informações genéticopopulacionais auxiliarão no manejo adequado. A identificação das UES foi um traço importante do nosso estudo, pois, conforme abordado no capítulo 1, a espécie S. brasiliensis, por exemplo, não foi incluída na lista vermelha brasileira, porque algumas populações da espécie já se encontravam em uma área de proteção ambiental (ROSA; LIMA, 2008). Entretanto, esse tipo de afirmação não pleiteia as populações, de potencial evolutivo único, existente na bacia do Alto rio Paraná, uma ecorregião aquática extremamente fragmentada por um sistema de usinas hidrelétricas. Por necessitarem percorrer grandes distâncias para completar seu ciclo reprodutivo, as populações de S. brasiliensis e S. hilarii do Alto rio Paraná estão sob risco de extinções a longo prazo, 7 Lei n /2009 dispõe sobre a Política Nacional de Desenvolvimento Sustentável da Aquicultura e da Pesca. Artigo 2, inciso I, definições: recursos pesqueiros são todos os animais e vegetais hidróbios passíveis de exploração, estudo ou pesquisa pela pesca amadora, de subsistência, científica, comercial e pela aquicultura.

159 156 caso nenhuma medida seja tomada. Pensando em viabilizar essas populações, a preservação de afluentes que possuam características semelhantes ao da calha principal é uma alternativa promissora (ROSA; LIMA, 2008). Por isso, propomos a criação de uma unidade de conservação em uma porção do Alto rio Paraná que apresente potencial em manter as populações das duas espécies. Uma região livre de hidrelétricas, situado em um trecho com características originais do rio, permitindo assim migração reprodutiva, desova e desenvolvimento de larvas, e que também é uma área histórica de distribuição para as duas espécies é no rio Turvo, afluente da bacia do rio Grande, situado no estado de São Paulo. Essa unidade de conservação protegeria não apenas as necessidades das espécies, mas também outras espécies de necessidades menores que despertam pouco ou nenhum interesse comercial. Incentivamos outros estudos que auxiliem a conservação das espécies de Salminus, tendo em vista a importância ecológica para a manutenção dos ecossistemas em que vivem. Quanto à utilização das espécies de Salminus como modelo biológico para compreender os processos evolutivos responsáveis pelo atual padrão de distribuição da ictiofauna sulamericana (capítulo 2), nós reforçamos que eventos de vicariância e geodispersão tiveram um papel importante. Entretanto, não descartamos a relevância das oscilações climáticas do Pleistoceno (HAFFER, 1982) e flutuações no nível do mar, principalmente do Mioceno (NORES, 1999). Diante da complexidade de padrões biogeográficos da região, acreditamos que as interações entre todos os eventos moldaram a diversidade da ictiofauna neotropical. O emprego das espécies para identificar assinaturas genéticas para os eventos biogeográficos, representa um grande avanço para estudos filogeográficos. Outros cenários biogeográfios também podem ser testados. Além das hipóteses Paleogeográfica e Hidrogeológica, a hipótese Museu apresenta um grande impacto nos processos de diversificação da ictiofauna neotropical. Segundo a hipótese, as incursões marinhas ocorridas no Mioceno, teriam fragmentado as populações de espécies com ampla distribuição isolandoas em áreas mais altas. Com isso, teríamos linhagens basais presentes nos escudos cristalinos e as linhagens mais recentes teriam surgido após as regressões marinhas e ocupado as terras mais baixas (HUBERT et al., 2007). A assinatura biogeográfica seria de áreas elevadas com altos níveis de endemismo (chamadas de refúgio), enquanto as áreas baixas teriam alta diversidade de espécies, porém baixos níveis de endemismo (HUBERT; RENNO, 2006). A criação de um cenário ABC para uma única incursão marinha não é complexa. A assinatura genética que esperamos para esse evento é de uma população ancestral, de tamanho efetivo Na, que no tempo ti (onde i representa os eventos de incursões marinhas conhecidos) sofre

160 157 uma fragmentação, resultando populações filhas fundadoras com tamanho efetivo menor que a ancestral. Posteriormente, há uma expansão populacional no tempo t1, t2...tn (os tempos estão condizentes com o número de populações filhas; essa expansão populacional não ocorre no mesmo momento, por isso necessitam de designações diferentes). Se outras incursões não ocorrerem, e se as populaçõesfilhas não entrarem em contato umas com as outras, esperamos que estas evoluam independentemente, chegando ao presente como linhagens distintas. Reconstrução do cenário de incursão é simples, porém dependendo do conjunto de dados deve ser melhor adaptado, o que também deve acontecer nos outros cenários biogeográficos aqui testados. A abordagem ABC deve ser considerada pelos pesquisadores em estudos filogeográficos, pois permite comparações de modelos alternativos, além de estimar parâmetros relevantes em estudos ecológicos, como tamanho efetivo populacional (BERTORELLE; BENAZZO; MONA, 2010). Ela é mais interessante que cenários baseados em verossimilhança porque utiliza modelos mais realísticos e mais complexos. Atualmente há uma variedade de softwares que utilizam essas análises. O DIYABC, empregado nesse estudo, apresenta algumas limitações como não ser capaz de considerar migrações nem sobreposição de gerações (BERTORELLE; BENAZZO; MONA, 2010). Como isso afeta o conjunto de dados avaliados é incerto. No nosso caso, a migração não é um problema, pois, uma vez ocorrido o evento alopátrico, as populações passaram a evoluir independentemente. Portanto, incentivamos sua utilização, principalmente, devido à interface amigável, permitindo o uso por leigos em linguagem computacional. Em suma, a presente tese providenciou um novo panorama taxonômico do gênero Salminus, com sugestões que devem ser avaliadas por especialistas. Também identificamos como as espécies estão relacionadas filogeneticamente entre si e quais os processos de vicariância e geodispersão foram os responsáveis pela diversificação do gênero. Estas análises nos permitiram propor medidas de manejo seguro para as espécies. Para uma próxima etapa, é interessante avaliar as variações morfológicas das espécies S. hilarii e S. brasiliensis coincidentes com linhagens mitocondriais, porém não com os marcadores nucleares aqui utilizados. Uma análise utilizando mais marcadores nucleares informativos ou até mesmo sequenciamento de próxima geração poderia oferecer um panorama mais acurado sobre o que essa variação representa: se são unidades taxonômicas distintas ou se são adaptações fenotípicas mediante ao ambiente que habitam.

161 158 Referências bibliográficas AGOSTINHO, A. A. et al. Patterns of colonization in neotropical reservoirs, and prognoses on aging. In: TUNDISI, J. G.; STRASKRABA, M. Theoretical reservoir ecology and its applications. São Carlos: International Institute of Ecology, p BERTORELLE, G.; BENAZZO, A.; MONA, S. ABC as a flexible framework to estimate demography over space and time: some cons, many pros. Molecular Ecology, v. 19, p , HAFFER, J. General aspects of the refuge theory. In: PRANCE, G. T. Biological Diversification in the Tropics. New York: Columbia University Press, p HUBERT, N. et al. Phylogeography of the piranha genera Serrasalmus and Pygocentrus: Implications for the diversification of the Neotropical ichthyofauna. Molecular Ecology, v. 16, p , HUBERT, N.; RENNO, JF. Historical biogeography of South American freshwater fishes. Journal of Biogeography, v. 33, p , LIMA, F. C. T. et al. Genera Incertae Sedis in Characidae. In: REIS, R.E.; KULLANDER, S. O.; FERRARIS Jr, C. J. Check List of the Freshwater Fishes of South and Central America. Porto Alegre, Edipucrs, p MORITZ, C. Strategies to protect biological diversity and the evolutionary process that sustain it. Systematic Biology, v. 51, n. 2, p , NORES, M. The implications of Tertiary and Quaternary sea level rise events for avian distribution patterns in the lowlands of northern South America. Global Ecology and Biogeography, v. 13, p , PEREIRA, L. H. G. et al. Can DNA barcoding accurately discriminate megadiverse Neotropical freshwater fish fauna? BMC Genetics, v. 14, p. 20, PEREIRA, L. H. G. et al. DNA barcoding reveals hidden diversity in the Neotropical freshwater fish Piabina argentea (Characiformes: Characidae) from the Upper Paraná basin of Brazil. Mitochondrial DNA, v. 22, n. S1, p , 2011.

162 REIS, R. E.; ALBERT, J. S.; DI DARIO, F.; MINCARONE, M. M.; PETRY, P.; ROCHA, L. A. Fish biodiversity and conservation in South America. Journal of Fish Biology, doi: /jfb.13016, ROSA, R. S.; LIMA, F. T. Os Peixes eiros Ameaçados de Extinção. In: MACHADO, A. B. M.; DRUMMOND, G. M.; PAGLIA, A. P. Livro vermelho da fauna brasileira ameaçada de extinção. MMA, Belo Horizonte, MG, Fundação Biodiversitas, ROSSO, J. J. et al. DNA barcoding Neotropical fishes: recent advances from the Pampa Plain, Argentina. Molecular Ecology Resources, v. 12, p , SATO, Y.; GODINHO, H. P. Migratory fishes of the São Francisco River. In: CAROLSFELD, J. et al. Migratory fishes of South America: biology, fisheries and conservation status. The International Bank for Reconstruction and Development/The World Bank, Washington, DC, Estados Unidos da América, p SCHAEFER, S. A. Conflict and resolution impact of new taxa on phylogenetic studies of Neotropical cascudinhos (Siluriformes: Loricariidae). In: MALABARBA, L. R. et al. Phylogeny and classification of Neotropical fishes. Porto Alegre, Brazil: Edipucrs, p SHIBATTA, O. A.; GARAVELLO, J. C. Estudo da variação geográfica em Salminus hilarii Valenciennes, 1849, das Bacias do Alto Paraná e São Francisco, através da análise morfométrica multivariada em componentes principais. Naturalia, v. 18, p , 1993.

163 Conclusões 1. Através da análise multiloci e utilizando o conceito filogenético de espécie, propomos um novo cenário taxonômico para Salminus. O gênero passa a ser constituído por seis espécies: S. affinis, S. franciscanus, S. brasiliensis, S. hilarii, S. sp. Amazonas (=S. iquitensis) e S. sp. Araguaia. 2. O ótimo threshold utilizado para identificar as unidades moleculares, calculado a partir do nosso conjunto de dados, foi menor do que aquele padronizado para peixes neotropicais. Devido às taxas mutacionais variáveis e diferentes histórias de vida, valores de threshold fixos acarretam problemas de sub ou sobreestimação de unidades moleculares. 3. A utilização do DNA barcoding não deve ser a única ferramenta de delimitação de espécies. A metodologia é eficaz na sinalização de prováveis incongruências com a taxonomia vigente que devem ser melhor investigadas. A utilização de mais marcadores moleculares informativos com heranças distintas é uma alternativa viável para esclarecimento do status taxonômico das espécies. 4. Os mecanismos promotores de especiação alopátrica das hipóteses paleogeográfica e hidrogeológica foram os responsáveis pela diversificação das espécies do gênero Salminus. 5. Os eventos de geodispersão e vicariância apesar de serem processos distintos podem gerar padrões biogeográficos semelhantes em determinadas situações. Entretanto, para análise ABC, ambos os eventos apresentam assinaturas filogeográficas distintas baseada na ocorrência (geodispersão) ou não (vicariância) de um efeito fundador na área colonizada. 6. A abordagem ABC deve ser considerada pelos pesquisadores em estudos filogeográficos, pois permite testar entre as principais hipóteses de diversificação da ictiofauna Neotropical (paleogeográfica, hidrogeológica e museu) a mais provável para o conjunto de dados avaliado. Além de estimações de parâmetros relevantes em estudos ecológicos, como tamanho efetivo populacional.

164 Apêndice Apêndice 1 Fotografia das MOTUs de Salminus estimadas na análise multiloci. (A) Salminus affinis (indivíduo não analisado). (B) Salminus brasiliensis (indivíduo SB_580). (C) Salminus franciscanus (indivíduo SF_035). (D) Salminus hilarii (indivíduo SH_160). (E) Salminus sp. Amazonas (indivíduo SI_026). (F) Salminus sp. Araguaia (indivíduo não analisado) 1. A barra de escala representa 5 cm. Fotos por (A) W. R. C. Flor, (B) (E) C. Machado. (F) P. Venere. 1 Fonte da imagem: VENERE, P. C.; GARUTTI, V. Peixes do Cerrado Parque Estadual da Serra Azul Rio Araguaia, MT. São Carlos : RiMa Editora, FAPEMAT, p.