地平線の彼方で

だな．．．

色々マニュユスクリプトに感想が付けてあったのを発見してその無責任さに大激怒してしまった．


このセンテンスをこう書き換えたというeditではなく，長々と感想．．．



もうね．．．あなた何様？？？って感じになってしまったわ．
パラグラフごとに，Goodとか．Let’s not focus on the RSC too much in the Abstract.


こんなのがだらだら書かれて，しかも，これまで論文を書いたことのない（かつ，泣き言を言って頼んで来たのに，何様？？？って感じだわ．

ノーベル賞をもらったHHMIのProfessor様のつもり？？？
相当何か勘違いされているのではないだろうか？




気に入らない点，こうしたいというものがあるなら編集したり，自分で書けばいいこと．編集禁止とは言っていない．もちろん後で同意できるものでないと駄目だけれども．



自分が英語で論文を書けないのに，なんだそれ？？？って感じ．




もうね．頭が悪いというか，理解不能なのよね．8年間もポスドクをして来て論文がゼロな訳．

おそらく，ロックフェラーというネイムバリューと，ノーベル賞ラボ出身というだけで，8年間論文がゼロであっても余裕で仕事が見つかるだろうけれども，二度と一緒に仕事をしたくないわ．
（所詮そんなものよ．素晴らしい仕事をしていたら．．．とか関係なく，ネームバリューよ．．．



僕をお前は上から目線だとか，いいたい人がまた出てくるだろうけれども，こんな人たちを相手にするとなると当然だわ．



口と態度は威張り散らし，中身はゼロ．


skype meetingも最悪．
彼一人で何も出来ないから手伝っているわけで，周りの人に助けてもらっているのなら，もう少しリスペクトできない？？？


彼がskype meetingで威張り散らしたあと，その後素直に従うという彼のキャラに付き合うのはもうかなり限界にきている．


切れたら駄目だというのは常にあるので，切れてないけれども，彼が逆鱗に触れることをしていることはな．

執筆能力もないのに主導権を握りたいのだろうか．．．
是非とも主導権を握れるなら握って欲しい．

さらにcoresponding authorが欲しいとか．．．





大激怒だったけれども，さすがに


この8年で論文を何本書いたことがあるのだ！



とは言わなかった．
が，8年で論文ゼロというのは，全く驚きがないな．当然然るべしという感じだった．

そこまで口に出していう必要はないけれども，学位を取って8年目にして1st authorの論文は，学位論文とreviewだけという体たらく．本来生存できないレベルの人を相手にするのは，本当に時間の無駄だということが非常によくわかった．

結局はそこなのよ．学位を取って8年もなにしていたの？ってこと．






彼には友達がいるの？？？って聞いたら苦笑していた．（普通に疑問に思ってしまったので

友達がいるなら，もう少しそのノーベル賞とっていないのに取った教授面はやめたほうがいいんじゃない？って誰か言ってあげなよ．．．って感じになる．友達ならね．．．って感じ．見ず知らずの人が言うのではなく，知った上での友達なら，彼のためになるのであれば言ってあげないと．．．




僕は興味がないから調べていないけれども，彼の大学院の時のボスは生涯で38本しか論文を書いていないしそのほとんどがレビューとか．．．で，Professorらしい．僕が調べたわけではない．


論文の数が全てではないとはいえ，ま，遺伝だわな．



論文を書いたことのない人に感想文を書かれてもね．．．

イントロを今さらながらこう書きたいというのであれば，是非ともお書きになればいい．8年間書けなかったもの（少なくともデータを取って3年間は）．突然レビューに通るものが書けるわけがない．

重要なのはレビューに通るもの．
書き散らした物は通らん．



I would shoot for ~ 600-700 words in the Intro.




こんな感想を書かれれば”は？？？”ってな感じになる．なにから突っ込んでいけばいいかわからないけれども，

I wouldってどういう意味？何様？？？ってことになる．こんな感想に付き合うほど暇じゃないし．．．書き換えたいならあなたが書いてはいかがですか？ということ．論文としてまともな雑誌のレビューを通るとは思わない．

できもしない人間がI would って笑かそうとしているの？？？ってな感じ．


バカにしているというか，こっちがバカにされているでしょ．．．
向こうが先制攻撃を仕掛けてこられたら，武器を手にとって反撃して防衛するのは当然でしょ？日本国憲法であっても保証されている．







イントロも書けなかったから僕に頼み込んだのに，I wouldって，自分でかけるの？？？だったら最初から書いてみな？それとも，書けという命令形？

I would　という仮定法は，そういうことを出来る人でないと駄目．意味不明になる．



イントロの文字制限出してこられたのは初めてだわ．
Natureだとトータルで結局は2000 wordsになるわけで，イントロが700－800 wordsにするって．．．








こんな感じとか，偉そうなことを言っても，結局センテンスに落とし込めなければ意味がないこと．
結局目の前にあるものをトランスレートする能力がないというよりも，なにも見えていないのだろう．でなかったら8年間も論文なしでいられるか？



構造があっても，解析する能力がないわけで，
mutationも僕が解析して，僕が面白いと思ったものを提案していたわけで，彼は言われたことをやっただけ．しかも率直にではなく，

結局言われた通りやって面白い結果が得られたと喜んでいたでしょ？
それなら，もっと僕から学ぼうとするなにかがあってもいいんじゃないか？


英語で論文の一つも書けないのにね．





あまりにも抽象的なことばかり演説されるので，聞いたのよね．

仮説は何？具体的にどう言う風に考えているの？


その答えは出てこない．

結局さ，こんな仮説もなしに，実験ができるからやってみました的なものを繰り返していたら論文なんて書けるわけがない．


なんのためにやったの？すら明確な答えが出てこない．
というか，はぐらかされる．




今後を考えさせられる人物だった．


ほんとぐったり．

基本僕にとっては，この論文は人生において全く必要にならない．natureに載るようなものあっても基本僕の仕事ではないし．このauthorsの中で一番割りを食っているのは僕だったりする．メリットはゼロよ．ゼロ．．．


結晶のデータをとって３年間も迷走し続けたこんな行き当たりばったりのプロジェクトがhigh profiled journalに載せられるわけがない．

迷走する以前のもの．
構造を決めて，3つのpeptideをつかってITCをしただけというもの．
結晶のデータを取るまでにどれだけかかっていたのか知らないけれども，データを取って3年間で，それだけ？

他の仕事をしてきたのならその成果があってもいいんじゃない？
それがゼロよ．．．ナッシング！！

8年あったら20本ぐらい論文書けるでしょ？ってな感じ．
なんのために結晶構造を決めたの？？？目的なし？？？

目を覚ませ！！って感じだけど，彼はもうね．．．





ただ，解析と論文書きには重大なというか，意味不明実験を全て，意味付けしてきたので，コントリビューションはあるので，無駄にしないためにも論文にしたいけれども，それ以上もそれ以下でもない．


一緒に仕事をして楽しかったと全く思えない，非常に残念な結果だった．


命を無駄に削ってしまった．こんなことをするために生きているんじゃない．

あの，例のヘリックスの途中にストップが入っていた驚きのコンストラクト(当然ながらinsoluble)を渡された共同研究．結局色々，コンストラクトを作り直して，テックに精製して，ITCでKd valueを測定してもらったのだけれども，言われているようなことは再現できなかった．


SGCが2012年に構造解析の論文を出しているので，調べればどこがヘリックスなのか余裕でわかるという前提．いつから始めたか知らないけれども，5年以上前に論文があるのに見ていないとすれば重大な欠陥がある．2018年に出た論文を引っ張っていっているのではない．

biochemistに1時間程度マニュスクリプトを読んだ程度の理解で問題点を指摘されるようなのでは重大度は大きい．．．



もともとのmanuscriptにおいていろいろ問題が噴出していたわけで，言われてみれば当然という結果に落ち着いた．

誰が書いた原稿なの？？？って感じの酷い原稿だったし．．．ライティングは別とはいえ．．．という問題．





彼らのコンストラクトに重大な問題があって，Kd valuesの解釈にも重大な問題があった．
modified peptideとunmodified peptide binding affinityの差がほとんどないとか．．．
つまり本来，見られるはずの差が彼らが実際に実験をしたSPRで見られないということは，何か重大な問題が放置されたままにあること．


あらゆるコンストラクトで1.5倍しか差が見られないというのはお笑いになる．
そのことはデータを見てすぐに指摘した点．






おそらくこの結果は伝えられるだろう．そしてこれ以上は政治なので，僕は関知しないけれども，そのまま論文にするかしないかは彼ら次第になる．




scientificな観点から（僕は政治家ではないので


ちなみに僕らの出したKd valuesの一部はpublishedされているNMR chemical shiftで求められたKd valuesと近い値を出しているので，さらに信頼できるグループの論文でもあるので，そっちが正しいのだろう．Kdは 0.5-1 mM



その論文も詳しく読んでいなかったのだけれども，また別のグループがFPでKdをだしている結果があるのだけれども(~10 uMなので100倍近いkd valuesがBBRCに報告されている．．．)，追試してもそんな数字(High binding affinities)は出なかったとも論文に明確に記載されている．


bbrcってその程度の雑誌？
1日でacceptとかあるらしいけれども，review systemが機能しているの？reputationを下げているだけじゃないの？って感じ．僕はそういうところには投稿しない．（PLoS Oneにも投稿しない）





FPはviscosityがあれば，anisotoropyがあるように見えてくるので，これも注意が必要．
lower binding affinityのものには使えない．
BSA (1 mg/mL)であっても，peptide も DNA oligoもbindingするようなことになりかねない．
実は粘性が高くなっているだけの話であることもあるので注意しなければいけない．
物によってはconcentration effectが全く見られrないものもあるので注意しないといけない．

だからわかりきっているものであってもコントロールが必要になってくる．
unmodifiedのものは付かないとわかりきっていても，実際にshowすることで，結果の信頼性が上がる．お金がかかるからとか．．．それなら初めから実験自体やめておいたほうがいい．もっとコストがかからない方法を探すべきということになる．バーテックも同じことを言っていた．が，実際に調べてもらった．

$5000ほどかけて，コントロール？
それが元々ないところ，お金も，リエジェントもないところはやったら根本的にダメってこと．
no control experimentsは本当に危険．






どうやって精製しているのかわからないけれども，pIが9.0もあるタンパク質ドメインであれば，DNA結合タンパク質でなくとも，nucleic acidsがnon-specificに付いてくる．
in vitroでligandに直接結合するKd valueを求めるにはpurityが重要．




問題点はproteinにnucleic acidsがベタベタ付いている状態では，ligand (この場合basicなhistone tail peptide)がnucleic acidsにnon-specificに結合するので，ただそれら，すなわちpeptideがnucleic acidsにnon-specificな結合を見ていたのではないだろうか？それだと1.5倍というのも納得できる．誤差の範囲だわな．．．





His tagだけでは元々綺麗にはならない．


だから，nucleic acidsが大量にコンタミしている状態のタンパク質を用いてkdを測定しても，modified peptideとunmodified peptideのKd valuesがあまり変わらなかったのではないだろうか？


つまり，CBBで染めたらワンバンドというのは見た目だけでお話にならない．
それとも見た目がワンバンドならOKってか？
という根本のサイエンスに対する態度にも関わる．

nucleic acidsも大量にコンタミしているけれども見えていないだけ．
一度Qカラムに通して見ればどれだけ大量に結合しているかわかる．
そして，Qを通していないSpのピークと，Qを通したSpのピークの差というのも見えてくる．

Qを通すと，ノンスペで付いているnucleic acidsが取り除かれるためにSpがsharpなピークが得られるけれども，Qを通さなければ，いろんなところでelutionされてくるので，だらだらとelutionされ，sharpなピークが見られない．




実験ノートを見せてもらえればすぐにわかる．
もし精製が本当にNiだけであれば，重大な問題があり，このような論文は通してはいけない．





それらが無知に伴うlow qualityの実験の問題点になり，下手するとコントロールがない結論だけが一人歩きして，再現性に問題が出るのではないだろうか？

再現性のあるノンスペを見ていたってことなのではないだろうか？

彼らも他のバッチを使って，再現性をみているとは思えず，1回で大量に精製したものでみていれば再現性のあるノンスペになるし，別のバッチで調べれば再現性がなくなるということなのかもしれない．





既に論文に出ていてわかりきっていることを，さらに自らの手で追試していくことで，実験結果の正しさを保証することができるのに，「そこはもうわかりきっているから，実験する必要がない」という風に考える人もいるのだろう．学生なら，その考え方はおかしくないかい？って注意喚起している．あとは自分で考えればいいってこと．難しい人はどうしようもない．．．




自分たちの実験結果を正当化させる，お膳立ての実験，すなわち，「コントロールで言われた通りの結果が出ているでしょ？その上で，こうやったらこうなった」という方が説得力あるでしょ？というわけで，引用で済ませようとするのは，その論文の弱点になる．そんなコントロールされているかどうかわからないものをresultsに書くなということになる．



本物かどうか，自分が確認しないまま本番の実験だけやっちゃう？って感じで恐ろしい．
東大，元分生研の加藤茂明ラボであったような言い訳だわな．
コントロールがコピペとか．．．重要性がチームで理解，共有されていないのだろう．指導教官の責任だわな．


あそこのラボは，ラボのプロトコルがweb siteで公開してあったし，見ていたけれども，黒歴史とかしてしまっている．あのページは一体なんだったんだ？？？って感じ．本当に実験していたのか？
根に持ってしまうのは被害者だからな．







実はその論文(FPをするとhigh binding affinityが見られるという）は今書いている論文にもサイトしてしまっているので，書き直しが必要なことがわかった．

色々なsequenceのpeptideを用いてFPでKdを求めているけれども，unmodified peptideを用いてそれがどういう値なのか出ていなかった気がする（明日もう一度チェック

これは僕の見落としだけど，もしunmodifiedのものがコントロールで使われていなければ，引用する価値は全くなくなる．


steady-state およびKon, Koffが求められているけれども，本当に？ということになる．
本来見られるであろうmodificationの差がほとんど見られないというのであれば，それはノンスペを拾っているということになりかねない．

もし，そこに既知のもので，論文として報告されているものがコントロールとしてshowされてあったら，違ったと思うけれども，今となっては，彼らは一体何を見ているの？？？ということにしかならない．


目に見えないものを扱っているわけで，常にそれが正しいものを見ているという証拠を提示しながらやっていかないと不信感が積もってくる．



例のドイツのグループの論文も1.5倍違うからいいのだ理論だけれども，到底容認できない．







もちろん，nucleosomeに対するbinding affinityというのであれば，そういうものを意図的に使うことが必要．だけれども，これはpeptideのように一筋縄にはいかないので工夫が必要になる．






実際にコンストラクトを作って，テックに精製してもらって，このnucleic acidsのコンタミしているのは実際に確認しているので，意図的に取り除くことが必要．
何も知らないままだと見過ごされている可能性は高い．

さらにこの場合のnucleic acidsのコンタミはgenomeだと細々に切り裂かれた残りカスがくっついているのでなかなか難しい．




そういえば，Dnmtをやっていた時に(2011年），1 mg/mlあるから．とどこかのラボから送られてきたHisのone purificationのサンプルを調べたことがあったけれども(NEBからではない

あれはSDSで流してCBBで染めたら1/10程度しかなかった．
その当時既に1 mg/ 1 L LB cultureで得られていたコントロールがあったので，え？というものだった．

案の定調べると大量のnucleic acidsがあって，ゴミだということがわかった．．．
つまりNi-NTAで落としてきた酵素に大量のnucleic acidsがノンスペシフィックに結合していて，それもelutionに含まれていた．さらにOD280でチェックすると1 mg/mL 数字上あったけれども，SDS/CBBで染めるとほとんど何もなかった．


lessonは3つあって
1つの方法で濃度を決定するのは危険なこと．
2つ目はpurityの低いものでOD280を使ったら危険ということ．
ちなみに260/280を見てもquencingしてしまっているので意味がない．結合していないフリーのnucleic acidsを見ているのではないので．
3つめはプロに任せるということ．素人が手を出してはいけない領域に手を出してしまうと．．．ってこと．聞けば教えてもらえるから，自分たちでやりたければ聞けば良いというだけの話．




たとえばどれだけnucleic acidsがコンタミしているのか？というのも，Sp columnでelutionさせた時にsymmetricなシャープなピークが得られるか？シャープなところが味噌になる．
2 CV以上に渡ってきたら問題があると考えないといけない．overloadも含めて．


得られなければ，nucleic acidsが結合している，結合していないもののヘテロな集団になるので，ピークはasymmetricに，ブロードにelutionされてくる．

あれ？って研ぎ澄まされた感覚がないとな．






カラムにクラックが入ったままでも平気で使っているとか，その結果resolutionが全くないのに平気とかいうのは問題外．全く目に入らない人もいるってのは驚いたし，まったく理解できなかった．
しかも黒ずんでいたいたし．．．

10% Bから90% Bにかけてピークが出るとか．．．おかしいと思う感覚がないとな．
これでいいんだとか意味がわからない．良いわけはない．．．







この場合はQカラムをSpの前に連結させて，nucleic acidsをできる限りSpに結合させる前に取り除いておくことが肝心になる．

信頼できるバイオケミストに相談してからやるのが一番だと思う．
無知はね．．．大火傷をすることになる．
知らなければ相談すればいいだけの話なのに，相談しないでそのまま突っ走ると．．．




これって，また説教案件か？？？ってな感じ．．．

とあるNMRの構造を見ていて，え？と思ってしまった．

NMRの構造は１エントリーにつきそれぞれ20個デポされているのでいろいろ見ていった．


古い時代の構造なので，あまり文句を言えないのだけれども，rotamerがとにかく悪い．
outlierが26%もあり，肝心な基質の認識部分が20個全部見たけれどもあやふやで，そのhydrophobic pocketのロータマーも，え？？？というのがいっぱいあった．



歴史的に，プログラムの問題もあるので，当時難しい面もあったと思うのだけれども，これ，直さない？って感じ．結晶だと，非公式にでも直せるのだけれども，NMRだとね．．．

ってことになる．




今の構造モデルでも物理的にありえないアミノ酸側鎖をモデルしているものもあるので，これら，なんとかしない？？？って感じ．


ラマチャンドランだと，微妙に．．．というものであれば良しとしてもいいかもしれないけれども，存在しない位置にカーボンがおかれて，，，というのは


結局そのデータを使って，解析する時に問題が出てくるわけで．なんとかならないのだろうか．．．という感じ．

チェアの学生の実験をみているけれども，チェアから僕の指導は非常に面倒見がいいと高評価を得ているらしい

（僕を猛毒の塊と思っておられる方がいるかもしれないけれども，毒にも薬にもならないものって何の役にも立たないのよ．）


あんな痛恨のミスをしてしまっても．．．
結局，4人でやっていながら誰も理解していないまま学生が実験をやってしまったという反省がある．
学生を除くと大の研究者3人だけれども．．．


逆に，大失敗があったから，もう失敗はできないというプレッシャーが出て来たからかもしれない．




前回の痛恨のミスがあったとはいえ，良かったことといえば，なんでそういう結果，これが大失敗なのか？というのがわからないままではなく，学生に全て説明したし，それを翌朝さらに学生がボスに説明できたみたいなので

言われたことをそのまま言っているだけとは思わないのよ．
理解しなければ，何が起こっているのか納得できる説明は出来ないので．




僕は実験の結果，解析することで，何がおこっているのか理解して欲しいし，それこそトレーニングの過程だと思うのよ．






別に公言する必要はないけれども，Thesisにいろいろ感謝を書いてくれている．別に僕はただのヒラの研究者なのにも関わらず．．．









それはともかく本当は，昨日学生さんにラボに来てもらって，いろいろ話をしたかったのだけれども，学生さんが，まじ実験と書き物がヤバイということで結局学生さんは来れずじまい．．．


なので，いろいろ論文を読んで完璧に彼らが何をしたいのか理解できたのでメールを書いておいたので，おそらく読めば理解できると思う．

ぶっちゃけ，彼らも何をしたいのか理解できていなかったと思う．．．
実験をする前にいろいろ論文を添付して送ってくれていたのだけれども．．．




ただ，こういう特別待遇は別にチェアのラボの学生というからではないのよ．
自分の時間を無駄にしないため．やっぱり費やした時間に応じて結果も出て欲しいし，学生さんもハッピーになって欲しいし．結果が出ても，この数字どう使うの？？？ってなったら無駄でしょ？ってことになる．




彼女もあまり理解していないのだろうというのが，全て理解した後にわかった（学生だししょうがない）．時間がなければただ彼らの希望を叶えるようなことに終始してしまうけれども，時間は積極的に取らないと相乗効果は得られない．




彼らはKoffを求めたいから，手伝って欲しいと言われたので，そりゃ，オモチャがあるから，数字を出すのに手伝うことはできるよ．でもその実験結果って本当に彼らが欲しいデーター？って考えると，もしかして違うんじゃない？？？ってことになりかねない．

しかも数字を出した後に．．．


なぜこのKoffで説明できるのか？しかもApp. Koffで．



学生さん相手なので，彼らが一体何を知りたいのか？？？というところから理解して，彼らに必要な数字はKoffではなく，Hill constantだということ，つまりcooperativelyを求めることが必要としていることを理解することができた．biochemist相手ならもっと違ったと思うけれどもしょうがない．．．

これはITCでstoichiometryを求めることでもサポートされるn=0.25になるか，n=0.5になるか．
binding siteは0.25で，unbound sequenceは0.5になればin vitroの実験は完璧になる．





一番の障壁だったのはbiochemistryのtechnical termにない言葉がpublishedされた論文で使われていて，それをcell biologyをやっている彼らが使って，そんな単語はbiochemistryにないと言うところから．．．専門用語というのはそういう為にあるので勝手に言葉を作ったらダメ．．．


他のbiochemistが書いた論文を読んで一気にコンセプトを理解できた．
JMB 2004だけれども，こんなに素晴らしい論文は久々に読んだ．さすがSirだけあるという感じ．
他の1つを読んだけど，おそらく書いている人が違うんだろう．．．



あとpublishedされた論文のmisunderstanding (というか非常にconfusedさせるパラグラフ）されていたので，



今年の6月ごろから始めたので，ちゃんと理解するまでに3ヶ月かかっているってかなり問題．．．

理解に時間がかかるけれども．．．
口では即答して，あ，できるできるとか言っちゃうけれども（非常に安請け合いだし．．．でもそうしないといけないような状況が作られている），やっぱりナイーブな質問はしづらいし，
でも一旦理解したら，歴史上何年も理解されていなかったことが，成功できなかったことが成功して来た過程を僕は持っているので，短時間では結果を出せないのかもしれない．




ただ，僕には彼らが本当に知りたいことが非常にクリアになったので，あとはデータ待ちになっているし，遅くても1ヶ月で完璧なデータを出せるということになる．原稿でどういう風に書いていくかも完璧に頭に入っている．



メカニズムはまだわからないけれども，なんかだいたいこんな感じだろうと言う想像はすでにあるので，それが正しそうかどうかはChIP-exoの結果を見れば，もしかしたらちょっと計算しないといけないかもしれないけれども，おそらくそれが正しそうなのがわかる．し，実験的にもそれは簡単に証明できるし，論文としてどうまとめていくかも全て頭の中に入った．

おそらく(G+C)/(A+T)の割合が鍵だろう．
これによってDNAのピッチが超微妙に変わってくるので．それが大きく影響しているのだろう．



結論は，biochemistなんだからもっと真面目に取り組んだら出来るんだから，最初から取り組めってことになるよね．．猛省．．．

細かすぎることを聞くから，あまり好かれないしね．．．別にツンデレキャラではないし，冷たくされるよりも優しくされたいしね．．．

のbinding assayをするとnon-specific bindingをover estimate してしまう可能性が非常に高い．


non-specificで結合しているbinding modeはDNAの末端で結合しているので，例えばKoffを求めても，リアルなKoffを反映しない．これはunder estimateになる．
つまり，全てのnon-specific DNA binding affinityはover estimateしている．


base contactしているアミノ酸だけではなく，phosphate backboneを認識しているArg, Lys, HisなどがDNA結合面にエンリッチしているので，そこがDNAの末端とsequence non-specificに結合してしまう．

ゲノムは基本的にDNA末端がexposedされることはDNA repair時でないかぎり通常ないのでnon-specificの結合が相当overestimateされるということになる．


これは非常に再現性の高い現象．
再現性があるからといって，見ているものが，見たいものを見ているとは限らない．

これをITC, FP, SPRでやっても基本は同じなので，手を変えても見ているノンスペは同じになる．

DNA binding proteinにGFPをつけて，細胞で発現させてレーザーでゲノムをズタズタにして，そこに蛍光標識したタンパク質が集まってきましたとかって本当？？？って感じ．おそらくmutantでも見えるだろうに．．．再現性の高いノンスペシフィックな現象じゃないの？？？ってな感じで，相当疑っている．

しかもめちゃくちゃ荒い実験だし．．．．
僕には理解できない．．．




たったの10倍しかちがわないじゃない？というのはずれている．それぐらいあれば現実には2000倍ぐらい違うんじゃない？って感じになる．




酷い場合はどう頑張ってもspecific, non-specific bindingがほぼ同じに見えることがある．




↑
は，根本的にcontrolで差が見られない条件で調べていて，mutationでpreferenceが変わったと言うのは問題．再現性とリアルを反映しているとは全く異なる．



ツイッターのピペットマンの下りではないけれども，２倍以内で違うというのはかなり誤差の範囲になる．

ピペットマンを正確に使っていたとしても，それ以前に，人間が絡んでくるとあらゆるところで誤差が生まれてくるので，元のタンパク質の濃度がというところからフィッティングエラーにもなるし，タンパク質のpurityの問題にもなる．




問題の本質はその２倍の違いを説明できるか？？？というところにある．
別の形の実験でも同じ結果を得られるか？これが誤差でないことを証明できるのか？ということにかかっている．


ただの現象論として数字を報告するのは無責任になる．
数字というのはすさまじいインパクトを持たせてしまう．


2017 Mol Cell, 2015 NARでも1.5x 違うということを僕の論文で書いているけれども，それは，結晶構造解析をすることで，GluとCyt, Gluと5mCの距離が違うのでファンデルワールスが影響して結合力に若干差が出てくるという説明があるから意味があるわけで，その説明がなければ所詮ただの誤差扱いになる．なにか小さなことでも完璧に説明するのは大変な作業になる．










僕の場合はもう少し長いコンストラクトを使うことでnon-specific bindingを抑えることができた．2012a NAR
specific / non-specificは10倍ぐらい違うので，まず，そういう条件を見つけた上で実験しないとダメだと言うこと．


他にも，ドイツのグループの怪しい実験があり，．．．
彼らは挙句には5hmCも結合すると言う超怪しいのを出していたりするし．．




どれぐらいこの短いDNAがin vivoを反映しているのか？ということを見るにはどれだけnon-specificをみないassay systemを作れるかにかかっている．



例えば150 mM NaClで調べるとnon-specific, specificな結合が同じように見られるかもしれないけれども，200 mM, 300 mM NaClにすればいいだけで，150 mM NaClにこだわる必要は全くない．
もちろん150 mM NaClで差が見られることもある．


核の中はドロドロなので，タンパク質を単体で取り出してきた時に核の中と環境は激変している．


ちなみに，結合する，結合しないというのは相対的なもの．
なので，below Kd valueで実験すればbindingするものも，していないように見えるし，over Kd valueで実験すればなんでもかんでも結合する．

"これは結合するのか？"

という問いには，アホか？って感じになる．
結合するしないは全て相対的なものになる．．．天才という人が言ってくるものだから，がっかりする．．．天才ならもっと違うきき方ができないのか？？？ってことになる．







なので，タンパク質のDNAへの結合の性質を見る時に，最も適した条件で見るのが必要で，150 mM でしらべれば，ノンスペもなんでもかんでも結合するというのは意味がない実験になる．

塩濃度を忠実に再現しようとしても，他のは無視するの？？？ってことになる．

10 mM protein concentrationだとin vitroの実験は全て結合する．








チェアのところの学生がDNA binding assayをしにきているのだけれども（僕が超専門家というのをチェアは知っているから），なぜか思ったような，論文に出ているような数字が出てこない．50倍違うというのはかなり大問題．



なぜ？？？

と思って困っていたのよ．再現性もあるし
ということで，いろいろ話していたら実はFull lengthを使って，論文ではdeletion mutantを使っていたからということ．．．


しかもN末のpIは3.8でDNA binding domainのpIは9.5





どうりで思ったような数字が出ないというのに納得できた．
何がどうなっているのかわからないけれども，１つはacedic patchとbasic patchでbinding surfaceがブロックされている．もう一つはacedic patchとDNA backboneがinterfereしてしまっている．






学生相手なのでもう少し実験を始める前にdiscussionをしておけばよかったと反省．
学生だからね．．．早く結果が欲しいとかあるのはわかる．が，これは教訓．．．


論文ではdeletion mutantが使われているのにFull lengthをなぜ使ったの？？？ということを聞いた．
彼女のコンセプトは，
deletionを用いたKdは論文に出ているから同じ実験をする必要性がないからfull lengthを用いた
full lengthのほうがin vivo dataを反映していると思った



ということらしい．簡単にまとめると．




僕は全く逆のことを考えるのよね．
deletionを用いたKdは論文に出ているから，それをそのまま使う．
常に実験をコントロールする上で追試を必ずする．
原稿を書く時に簡単に書ける．



full lengthは．．．
本来in vivoで，今回の場合，acedic patchは他のタンパク質と相互作用して表面に出てこない（確率が高い）ので，単体のfull lengthを取り出してきても，それが何を反映しているかわからない．
さらにdomainを用いることで，シンプルな実験で非常に単純化できる．

複雑な生命科学の現象を単純な，そして美しい形で記述する．それこそが職務だからな．
複雑なものを複雑な形でshowしても意味がない．



とある人には，ドメインはサイエンスではないと怒って言われたことがあるけど．．．
ええ，根に持つタイプです．．．





ということで，もう一度コンストラクトの作り直しということになった．．．
プライマーのデザインから手伝い，PCRも一緒にやってmolecular cloningも一緒にということに．．．


軽くこれまでの2ヶ月ほど無駄にしてしまったのは申し訳ない．．．ただ，自分がこうしたい！というのを前面に出してこられれば，尊重してしまうわけだし．．．本人があまり理解していないと言えばそうなる．．．




つまり，実験を日々夕方の５時以降も頑張っていても，実験のコンセプトやデザイン，コンストラクトの作り方が甘いとあらゆるものが無駄になるということ．

今まで積み重ねてこられたものから学んでいくことが大切で，なにか新しいこと１つでも見つけられればいいんじゃない？思わぬところで躓いたら，その理由を考えて，その考えたことが正しいか一つ一つやっていけばいいわけじゃない？派手さはないけれども．．．（派手な方が学生に人気がある．．．）



別に今の仕事に固執してnatureに論文を出そうと思わなくってもって感じ．数年に1つ，いい仕事を出せばっってな感じじゃない？








タンパク質の精製の方法をいろいろ知っても，肝はコンストラクト作りになる．
ヘリックスの途中でstopを入れたりしたらダメなのと同じで，１アミノ酸違えば劇的に変わってくる．

手伝うことは僕は別にいいのだけれども（知識を抱え込むつもりはないので），月曜日の9時6時のほとんどすべてがヘルプだったわけだけど，最初に情報を小出しにしたりされるとね．．．意図的にではないのは理解できるけれども，喋りすぎってのは良くない．こっちが質問する機会がないと．．．



しかもナイーブな質問をあえてしないといけないわけで．．．
で，結果を見て，あれ？おかしい．ってなるってループ．どうよ．．．って感じになる．．．

今回のは全くゴミではないけれども，あのあれは，完全にゴミだったわけだし．．．




ナイーブな質問って，無視したらダメだと思うし，そういう肝のところを向き合わないでいい仕事はできないだろう．．．

本当にバカにしているの？？？ってところまで確認していきたいのよ．
実際はそんなことも知らないの？？？ってことになる．やっぱり目立つ方にベクトルが向くのは仕方がないことだけれども，，，なので僕は地味な仕事ばっかりやっているのだろう．．．



個人的に近くに信頼できる気軽に相談できるbiochemistがいて欲しいと思う．
常に，これが正しいのだろうか？という不安とともに闘っているので．




全ての情報はテーブルの上に出して，その上でということでないと．．．
いろいろ頭を使うのに１週間，1ヶ月かかるかもしれないけれども，きっといいアイデアが出てくると信じてほしいというのが希望．
配列を見ただけでそこはヘリックスだとか，ストランドとか，見えてくるまで見るわけなので時間がかかる．



N末端をみて，pIを計算する前から，これはかなりacidicだということが見てわかったけれども，学生はポカンとしていたわけだし．．．（アミノ酸のレターって暗号に近いよね．．．）biochemistにはそういう能力が標準で備わっているわけだし，同じものを見ても違うものを見ることができるように訓練されているわけだし．頼るなら全面的に頼る方がいいと思うのよね．


ちなみに自画自賛だけど，あれはすごかった．そこまでうまくいくとは思わなかった．まさか本当にやってみたの？？？とちょっと疑ってしまった．鉄板はCys-to-Serでしょ？ってことだったのだけれども（これはまた論文として発表されてから）




専売特許にしておきたい人もいるけれども，別に僕はそうではないし．
僕だって全てをカバーするだけの論文を一気に読むのは不可能だし，その部分はサポートして欲しい．




はぁ．．．大失敗だった．．．

higher resolution data setの時にphosphate backboneがalternative conformationsをとることがある．

数回refinementをした後に，fofc mapをみると，phosphate backboneのまわりに緑のデンシティーが見えることがある．おそらくalternative conformationをとっているためで，alternative conformationを作ると緑が消えてくる．


cootでphosphate backboneをreal spaceで移動させて，alternative conformationを作ろうとするとあまりうまくいかず，とにかくaverageのところに移動してしまう．


僕が使っている方法は，
1. cootでalternative conformationを作る．別にそのままでOK
2. baseはalternative conformationを作っていなければ，alternative conformationsをatomをdeleteしていく
3. 保存して，それをもちいてsimulated annealing (Cartesian)をして，結果をチェック
4. だいたいこれでうまくいく．
5. resolutionによるけれども，別のところがおかしくなっている部分もあるので（特に金属とコーディネートしているアミノ酸），Phosphate backboneの正しい部分だけtextでコピペをする．
5. real spaceで再度リファインする．cootでreal spaceをすると元に戻るのでcootは使わない．

だいたいこれでうまくいく．
ちなみにsimulated annealing omit mapを作るときに金属原子をそのまま除いてしまうと，え？って感じになる．なので，occupancyを0にして，その他のrestrainsをそのまま残したままでないと，ぐちゃぐちゃになってしまうので注意しないといけない．







ちなみに，DNAを酸性の液にさらすと，このPhosphate backboneのところで切れる．
negative negative になるので，そこが構造的に弱くなる．


誰かが，酸性の液に浸すと，mycなどを使っていないのでガン化が起きないとか言っている偉い人達がいたけれども，ランダムにphosphate backboneで切れてしまうので，そんなのは修復出来ないので，apoptosisを起こして死ぬ．

別にそんなことを知っていなくとも，southern blottingをするときにHClの酸性液に浸すのを知っている人達なわけで，その目的がDNAを切断することであることをわかっている筈の人が，酸性の液に浸すとガン化が起こらないとか言っているのは吹飯もの．


化学を専攻していたとからしいけれども，chemistry majorならDNA，細胞を酸性の液にさらすことはしない．




フェノールでもTE saturated, もしくはTris-pH 8.0でsaturateしたものを使うのもそのため．

核酸と言う酸性のものを保存するには弱アルカリ性の溶液である必要がある．
pIとbuffer pHを同じにしてはいけないのはケミストリーの基本．



だからprimerを溶かすのは水ではbuffer actionがないので，10 mM Tris-Cl, pH 8.0に溶かす方が安定に保存できる．

なんかさ．．．税金が高い．．．
どれだけ税金払っているの？？？って感じ．


節税対策なにする？？？みたいな感じ．
やっぱり家を買ってローンを組んで．．．となるのかなぁ．
ハワイに家とか買わないよ．まじ日本からハワイまで以上に遠いので．田舎に住んでいるので（）飛行機も乗り換えがあるので12時間じゃ無理だった．



ローンは金利分がdeductiveになるので，現金で買っちゃうとメリットが少ない．



401Kはもうほとんど入れていないので（計算上，将来的には$1Mまで十分余裕なので）最低額しか入れていない．．．Rothには入れているけれども1月に$5500 / yearの枠の全額投入しているので，


なぜか税金を払いまくっているのでMedicareもなぜか高いし（1ヶ月$168ぐらいの3ヶ月まとめ払いなので，結構）．．．そんなに収入があるわけでもないのに．ただ，仕事でもらうお金はお小遣いみたいなものだし，右から左へ課税口座に．．．健康保険があれば十分なのでどっちでもといえばどっちでもいいになるのだけれども．

貯蓄性の保険の利回りは非常に低すぎるので，そのまま投資している方がいいと思われる．
万が一ということでと言われているのだけれども，掛け捨ての方がましな気がする．




ちなみにFidelityの調査では401Kの口座の平均残高は$100Kらしく，$1M以上は口座の8%になること．老後資金はかならず投資することということがコメントされていた．年齢層は聞き逃したのだけれども．．．

重要なことは，投資教育が重要で，定期的に少額でも継続して投資し続けることで，投資でないもの（元本保証の貯金とか）では対応できないということに．


こういう金融は，中学とか高校で勉強する機会があればいいと思う．
受験の方がそんなに大切か？？？と思ってしまう．
お金を借りるのも，額ではなくって金利が全て．




ぶっちゃけ，詐欺が蔓延している日本でそんな投資教育なんて無理だと思うけれども，投資し続けなければ，元本保障にこだわり続ければ，その分働き続けなければならないということになる．
若い間はいいけれども年齢をとってくると，病気もするし体も動かなくなって来るし，親の介護が必要になるかもしれない．全てを今の基準に考えていると大変なことになる．誰もが年をとるわけ．


教育関係者には
お金儲け=悪みたいなのがあるような感じで
資本主義の基本だと思われるのに．．．



投資教育がないところに退職金などで一気にお金を手にするとで，リスクが高く，手数料が高いところに，銀行員の言われるままに投資して損をして．．．というのはね．．．銀行員は販売できればそれで満足で，運用結果なんてどっちでもいい．と考えているもの．


運用結果が思うようにいかなければ特別配当をして食いつぶして，さらには看板を付け替えて新しいファンドに乗り換えさせることでさらに手数料を得る．


GCOEみたいなもの．失敗したら看板だけ付け替えてモデルチェンジ．．．


バブル時代に山一が損失補填をしたのも大口の企業だけだったわけだし．個人投資家にはもともとそういうもの．





ちなみに，毎日日雇いで生きていくのが精一杯な人がファイナンシャルプランナーの資格を取っても吹き飯ものになる．．．自分のファイナンシャルプランもできていないのに，人様の資金を？？？
資格があれば正社員になれるいうものはほとんどないんじゃない？資格って正社員の人がとるから意味があるから．．．




一発逆転という思想は非常に危険．
研究課題を選択して集中させているのも同じこと．

こつこつ積み重ねていけばいいところを，一発逆転の思想が入ると，ハイリスクハイリターンを狙ってしまう，かつ，ある程度勝った程度では満足いかないで，必ず負けるまでやってしまうこと．




トルコリラ買いポジションも．目先のスワップ金利をちらつかせて，手数料で儲ける．
負けが込んで来るとその負けを取り戻そうとする力が働くので，さらに買いポジションを．．．となり泥沼．さくっとロストカットするのがいいとわかっているのだけれども，なかなか出来ない性質がある．逆に＋になると欲をかいてしまうので，ーに転じて祈りが始まる．．．

そして買いポジションはヘッジファンドが根こそぎ刈り取っていく．あんな不安定な通貨で長期ホールドしていたらスワップ金利でマイナスを補えるとか，笑っちゃうわ．GEと同じで，50%になったものが過去と同じ価格に戻るには2倍になることが必要．ちょっとした金利，配当では焼け石に水．


さっさと損きりをして，ローリスクハイリターンのアマゾン，アップル，グーグル，ネットフリックスに投資しておけば安心できるわけだし．（個人的にフェースブックはあまり好きにはなれない．必ず飽きが来る．）


トルコリラ円がロスカットされるかどうか不安で寝れないというのはリスクの取りすぎ．

あと根拠のない底値主張が出て来る．ここが底値だから買いを入れよう！！って．
これって１トルコリラ30円の時と全く同じロジックが展開されているわけで，もう前が全く見えていないのだろう．人間の特性だししょうがない．ここで損きりをして．．．ということができる人は本当にストイックな人だろう．相手はヘッジファンドのAIなので，それぐらいでないとダメだと思うけど．．．

下落時に数秒？数分で売りが出てすぐに買い戻されるというのはアルゴリズムの欠陥．だれがペイするのか？そこに買いポジを持って，レバレッジをかけまくって，資金がかつかつの人からってことになる．









USの株式に投資すればいいだけの話だけれども，実はかかる費用が違っている．%で効いてくるので，少額だとファンド，もしくはETFにメリットがあるけれども，$500Kを超えてくるとかなりコストがかかってくる．

簡単にいえば，日本語への翻訳のコスト


なわけで，年率0.05%のExpense Ratioが日本でだと同じものが0.30%になっていたりする．
実際，税金のあれもあるのだろうけれども，%で効いてくるので，
日本側の取り分が0.25%って，何もしていないのに多すぎない？？？って感じ．
無駄が多いのよ．．．


$100K当たり，$50が$300になるというのは相当大きい．１つのファンド，ETFの運用は$10B程度以上なので，0.10%であっても$10Mの売上総利益になる．それぐらいないとマイナスになるらしい．

年率1%のexpense ratioなんてアホくさすぎるわけで，これってファンドの維持費なわけで株価が上がろうが下がろうが，毎日徴収されている．経済が下向きな時に，利益も出ていないのにさらん年に$1000も払うか？って感じになる．