| *1 | 普通に買えるエタノールは99%程度の濃度である。モレキュラーシーブスや無水硫酸銅を加えて無水エタノールを作っておく。 | |
| *2 | パラフィンは高融点のもの（60℃程度）と低融点（54℃程度）のものがある。これらを混合して使うか、必要に応じて蜜蝋を加えて粘りを出す。またパラフィンは再製する(使用済みパラフィンを濾紙で濾して再利用する）と、組織との馴染みがよいとか薄切しやすくなるとかと言われている。 | |
| *3 | 大きな組織の場合（哺乳類など）、陶器の包埋皿などが売っているのでそれを使うと良い。しかし、棘皮動物の胚のように小さな組織の場合包埋皿は大きすぎるので、方眼紙やアルミホイルを箱形に折って包埋皿の代わりにする。 | |
| *4 | 40℃の恒温庫はパラ/キシ用。60℃の恒温庫はパラフィン用、用いたパラフィンの融点の2-3℃高く設定する。 |
| 1) | 固定標本をよく洗い固定液を抜く。この時、固定液の種類によって洗浄液に注意すること。つまり、ホルマリンやグルタールのような水溶液性の固定液の時はPBSで、カルノアやエタノールのような有機溶媒固定の時は、基剤の有機溶媒の濃度に合わせてアルコールで洗浄する*1。 |
| 2) | (50), 70, 80, 90, 95, (99), 100%の不連続なエタノールシリーズを数十分から数時間ずつ通すことにより脱水する。有機溶媒固定の時は、アルコールシリーズの途中から始める。 ※マウスの脳で、70％EtOHは1日程度(数回交換)、その他のステップは1時間程度と言われる。処理時間が長すぎると組織が堅くなるので注意が必要。 |
| 2.5) | 卵黄や脂質の多い組織の場合、ここでクロロホルム処理を行う。クロロホルム：エタノール=1:1、100%クロロホルム、クロロホルム：xylene=1:1といったシリーズを通してもいいかも。クロロホルム処理は免疫染色に影響を与えないと言われているが、クロロホルム処理していない組織も用意して、確認してみる必要がある。 |
| 3) | xyleneを数回交換し乍ら完全に脱水する*2。 30-60分×2～3回 |
| 4) | パラ/キシ（パラフィン：xylene＝１：１）に浸す。１回くらいは交換する。 |
| 5) | パラフィンに移す。1-2回交換する。 60分×2～3回 |
| 6) | 氷を入れた水を適当な容器に入れておく。 |
| 7) | パラフィンの浸透した組織を包埋容器に移す。大きな組織は熱したピンセットを使って、棘皮動物の胚などの小さなものは熱したピペットなどで移す。 |
| 8) | すぐに冷水につける。ただし沈めてしまわないこと*3。 |
| 9) | 解放面に息をかけてパラフィンの被膜を作らせた後*4、冷水中に沈める。 |
| 10) | しばらく放置して、完全に固める。 |
| 11) | 固まったパラフィンブロックは、涼しいところまたは冷蔵庫で半永久的に保存可能と言われている。 |
| *1 | 先にも書いたが、ホルマリンやグルタール固定したものはPBSなどの水溶液でしっかり洗う。70% EtOHやブアンで固定した場合は、70-80% EtOHから、TCAで固定した場合は90-95% EtOHから、カルノアで固定した場合は100% EtOHからアルコールシリーズを通す。 | |
| *2 | 脱水が不足していると、xyleneに移したときに組織が白濁して使えなくなってしまうので十分にEtOHで脱水する。また、EtOHの残留が多いとパラフィンが浸透しない。ただし、EtOHもxyleneも処理が長すぎると組織が堅くなるので注意すること。 | |
| *3 | 四方が固まった後に次の行程に進む。 | |
| *4 | パラフィンの被膜の形成が不十分だと、ブロック内に水が入り込み悲しい結果を生む（後に薄切しているときにブロックから水が出てくる）。 |
| スライドガラス | |||
| パラフィン伸展台 | |||
| 貼り付け剤(お金のある人は各試薬メーカーから出ている製品をお使いください) | |||
| 古典的には卵白グリセリンが使われる | |||
| 1. | 新鮮な鶏卵から卵白を採る。 | ||
| 2. | よくかき混ぜる（プロトコールによって「泡立てるな」というものと「よく泡立てろ」というものがある) | ||
| 3. | 2-3重にしたガーゼでろ過する。 | ||
| 4. | 当量のグリセリンを加えて撹拌する。 | ||
| 5. | 防腐剤(チモールを一粒、あるいは、ホルマリンを数滴)加えて冷蔵保存。 | ||
| 自家蛍光、抗体の非特異吸着、染色のバックグランドなどが気になる場合は、アルブミン・グリセリンを使う。 | |||
| 25mg/mL 卵白アルブミン in 50% グリセリン ※小分けして凍結保存する。 | |||
| ☆貼り付け剤を使いたくない場合は、シランコートスライドガラスやpoly-L-lysinコートスライドガラスを使う。 | |||
| 1) | スライドガラスを超音波洗浄し、よく乾かしておく。 |
| 2) | スライドガラスの切片を貼り付ける面に、アルブミン・グリセリンをごく少量垂らす。 |
| 3) | キムワイプを折りたたんで適当な大きさにし、アルブミン・グリセリンをスライドグラスに薄くまんべんなく塗り広げる。 ※「ちょっと足りないかな?」と思うくらいが適量。 |
| 4) | ホコリが付かないようにして(プレパラートボックスなどに入れて)保存する。 ※半乾きになったくらいが「貼り付け頃」！！ |
| 5) | 伸展台を37-40℃に暖めておく。 |
| 6) | アルブミン・グリセリンを塗った範囲に、蒸留水をたっぷり滴下する。 |
| 7) | この蒸留水の上に切片をのせる。 |
| 8) | スライドガラスを伸展台の上に置き、充分に切片を伸展させる。 |
| 9) | 2-3cm角に切ったろ紙を使い、標本の位置を修正しながら余分な水分を除去する。 |
| 10) | 割り箸などを枕にしてスライドグラスの一端を高くし、そのまま静置して余分な水分を一方に寄せる。 |
| 11) | ろ紙を使って充分に水分を吸い取る。 |
| 12) | 枕を外してスライドガラスを水平に静置させ、一番程度放置する。 ※ホコリが付かないようにカバーをすること！！ |
| 13) | 貼り付け終わったスライドガラスを、プレパラートボックスなどに保存する。 |
| 14) | 伸展台のスイッチを切っておく。 |