Примеси, методы контроля, валидация метода анализа

Лекарственые средства, полученные техникой рекомбинантной ДНК (биофармацевтические ЛС)

Продуктами, получаемыми с использованием методов рекомбинантных ДНК являются:
- белки и полипептиды, получаемые экспрессией соответствующего (значащего) гена, введенного в составе плазмидного или вирусного вектора в клетку микроорганизма или в клетку эукариотического продуцента.
(гормоны, антитела, ферменты)
- антигены для вакцин
(молекулярные антигены).
- низкомолекулярные соединения
(антибиотики, витамины, углеводы, аминокислоты)

Перечень разделов фармакопейных статей лекарственные средства

ОСТ 91500.05.001.00 "Стандарты качества лекарственных средств. Основные положения"

• Содержание действующего вещества (в процентах или ЕД)
• Описание
• Растворимость
• Подлинность
• Температура плавления (разложения), или затвердевания, или кипения
• Плотность
• Удельное вращение
• Удельный показатель поглощения
• Показатель преломления
• Прозрачность раствора
• Цветность раствора
• рН или Кислотность или щелочность
• Механические включения
• Посторонние примеси (родственные соединения)
• Показатели чистоты (хлориды, сульфаты, сульфатная зола и тяжелые металлы и т.п.)
• Потеря в массе при высушивании или Вода, определяемая методом К.Фишера
• Остаточные органические растворители (в случае их использования на последней стадии технологического процесса)
• Пирогенность или содержание бактериальных эндотоксинов (ЛАЛ тест)
• Токсичность
• Содержание веществ гистаминоподобного действия
• Микробиологическая чистота или Стерильность
• Количественное определение

Красным цветом помечены те показатели, описанные в ОСТе, которые имеют отношение к биофармацевтическим объектам. Непомеченные показатели, такие, например, как температура плавления, не могут измеряться в рекомбинантных белках и прочих объектах биофармы.

О чем мы будем говорить?

1. Виды загрязнений.
2. Законы аналитики Д.М.Кулиша.
3. Валидация метода анализа.

Виды загрязнений

Фармацевтические препараты и активные фармацевтические ингредиенты (АФИ) могут быть контаминированы другими фармацевтическими препаратами или АФИ, детергентами, микроорганизмами или другими материалами (например, частицами, переносимыми по воздуху, пылью, смазочными веществами, исходным сырьем, промежуточной продукцией, вспомогательными средствами)».

С точки зрения ICH Q6b

(International Conference on Harmonisation of technical requirements for registration of pharmaceuticals for human use. Specifications: test procedures and acceptance criteria for biotechnological / biological products. Q6b. 1999).

Примеси бывают двух типов:

1. Процессуальные примеси:

• 1.1. Производные клеточного субстрата: остаточные нецелевые белки продуцента, балластные молекулы ДНК или ее фрагменты, компоненты клеточных стенок.
• 1.2. Производные клеточных культур: индукторы, антибиотики, плазма, компоненты питательных сред.
•  1.3. Производные «downstream» процесса: ферменты, химические и биохимические реагенты, неорганические соли, растворители, носители, смытые с хроматографических колонн лиганды.
•  1.4. Технологические: следы других ЛС, детергенты, технологические материалы (пыль, смазочные вещества…).

2. Родственные примеси:

• 2.1. Продукты ферментативной или химической деградации.
• 2.2. Модифицированные формы целевой молекулы: дезамидированные, изомеризованные, окисленные формы, формы с некорректно замкнутыми дисульфидными связями, формы с некорректными конъюгированными остатками (гликозилирование, фосфорилирование).
•  2.3. Агрегаты целевого соединения.

Примеры типичных биофармацевтических родственных примесей:

• Изменения в последовательности аминокислот – за счет спонтанных мутаций, наличие N-концевого метионина при синтезе в прокариотах;
• Изменение молекулярная массы – за счет деградации под действием клеточных ферментов, димеризации или олигомеризации;
• Изменение заряда – за счет дезамидированных аминокислоты, нарушения пространственной структуры;
• Изменения пространственной структуры – неправильное замыкание S-S связей, изменение аминокислотного состава;
• Изменение, утрата способности к специфическим взаимодействиям, т.е. потеря активности – за счет нарушения последовательности, пространственной структуры, олигомеризации.

Законы аналитики Д.М.Кулиша

Пояснение:
Нижеописанные законы, очевидно, являются интуитивно понятными для любого профессионального аналитика. Но даже профессионалу будет полезно увидеть и прочувствовать то, что сформулировал Дмитрий Михайлович Кулиш в результате своей карьеры. Мы здесь приводим эти законы намеренно, так как верим, что их знание принесет пользу, особенно начинающим аналитикам-фармацевтам. С уважением к Д.М.Кулишу.

Первый закон аналитики

В одних условиях должны быть поставлены:
- Эксперимент
- Позитивный контроль (стандарт)
- Негативный контроль (базовая линия без активности)

Представим себе один из самых важных методов анализа в фармацевтическом производства, гель-тромб ЛАЛ-тест, метод контроля бактериальных эндотоксинов (липополисахаридов клеточной стенки). Если мы задаемся целью определить содержание эндотоксинов в пробе субстанции, то мы должны одновременно с этой пробой проанализировать пробу, в которой содержание эндотоксинов точно известно (например, контрольный стандарт эндотоксинов, КСЭ - это будет позитивный контроль), а также пробу, в которой точно известно, что эндотоксины отсутствуют (например, ЛАЛ-чистую воду категории endotoxins free - это будет негативный контроль). Позитивный контроль проверяет качество выполнения всех операций процедуры анализа (или, говоря производственным языком, соответствие проводимой процедуре СОПам, стандартным операционным процедурам). Негативный контроль проверяет работоспособность всех единиц метода контроля: реактивов, оборудования и др. (например, один из реактивов оказывается бракованным).

.

Второй закон аналитики

Истина проясняется только через несколько независимых (ортогональных) методов

Возьмем в качестве примера все тот же гель-тромб ЛАЛ-тест. Мы можем определить содержание эндотоксинов в пробе, установив какое-то значение этого параметра, например, 100 ЭЕ/мл. Но можем ли мы быть уверены, что это именно 100 ЭЕ/мл, а не, скажем, 150 ЭЕ/мл? Можем ли мы быть уверены, что реактивы в условиях нашего ЛАЛ-теста не ингибируются минорными компонентами пробы? Чтобы подобного сомнения не возникало, и нужен ортогональный метод контроля. Например, метод определения пирогенности на кроликах. Ортогональный - значит, его принцип отличен от принципа гель-тромб ЛАЛ-теста. А вот если мы будем использовать хромогенный ЛАЛ-тест, то он все так же может показывать заниженные значения липополисахаридов в пробе, так как гель-тромб и хромогенный методы не являются ортогональными.

Основные методы аналитической биофармы можно представить следующей картинкой; в ней же отчасти отражены ортогональные друг другу методы.

Третий закон аналитики

Разработка инновационного препарата и его технологии получения должны начинаться с разработки внутреннего стандарта.

Валидация метода анализа

Зачем проводить валидацию методов контроля? Причин несколько:

• Трансфер технологии
  кто-то должен легко воспроизвести то, чему Вы учились многие годы
• Неусыпный контроль качества
  Контролироваться должны не только продукты, но и методы контроля
• Валидация = задокументированное доказательство надёжности методов контроля

Что понимается под валидацией?
ГОСТ Р ИСО 9000-2001
Подтверждение на основе представления объективных свидетельств (3.8.1) того, что требования (3.1.2), предназначенные для конкретного использования или применения, выполнены, декларируемые свойства и характеристики подтверждаются, а поставленная цель (предназначение системы, комплекса, устройства и т. д.) достигнута.

Естественно, валидация методов анализа должна проводиться осознанно, а не формально. Задача специалиста, который проводит валидацию метода анализа (как правило, это специалист отдела обеспечения качества) - в первую очередь, осознать смысл этой процедуры. Тогда сама валидация будет выполнена грамотно.

А осознание смысла валидации включает:
*** Понимание принципа метода анализа
*** Понимание философии GMP и GLP
*** Математические (статистические) знания
*** Понимание критериев оформления работы

Рассмотрим эти четыре пункта на примере высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ).

1. Во-первых, надо точно знать аппаратный состав системы: какие функции выполняют те или иные блоки, какие у этих блоков возможности и ограничения, какие функциональные диапазоны допустимы для каждого из блоков. Например, одним из блоков ВЭЖХ системы можно считать ВЭЖХ-колонку. Она имеет определенную геометрию (диаметр и длину), определяющую скорость потока, а следовательно время анализа и расход подвижных фаз, а также давление в системе; она упакована сорбентом с определенным размером частиц (влияет на эффективность разделения, давление в системе, чувствительность метода); частицы имеют определенную пористость (влияет на эффективность и селективность разделения, устойчивость к механическому воздействию, срок жизни); каждая частица имеет заданную химическую модификацию (влияет на тип подвижных фаз, сорбционные возможности, эффективность и селективность разделения и на многое другое). От подбора и грамотного определения функционирования всех и каждого блока в системе зависит и то, как и по каким параметрам проводить валидацию (один из самых показательных пунктов в валидационном протоколе - см. устойчивость метода).



2. Во-вторых, надо знать характеристику образца: его природу, концентрацию, содержание целевого компонента, как проводилась (и проводилась ли) пробоподготовка.



3. В-третьих, надо знать, что конкретно анализируется; что является результатом анализа и как оно измеряется (особенно важно, если измерение проводит софт прибора: по каким формулам и алгоритмам прибор будет проводить расчет тех или иных показателей).



Например, с помощью метода ВЭЖХ мы планируем определять концентрацию целевого компонента. Очевидно, что для такого контроля мы пользуемся методом сравнения со стандартом (проба с известной концентрацией целевого компонента).
В ходе анализа мы получаем значение площади определенного хроматографического пика; площадь пика по какому-то закону (чаще всего прямой пропорциональности) зависит от концентрации компонента:

A=f(C)

Если, как мы предполагаем, гипотеза о функции является линейной зависимостью, то определив математический закон вида Y=kX+b и определив в ходе нескольких хроматографических заколов площади стандарта, можно произвести расчет концентрации в экспериментальной пробе:

(на данном графическом примере b=0, а концентрация стандарта 1мг/мл)

Но даже в этом простом примере есть свои неясности. Скажем, а в каком диапазоне концентраций закон имеет линейный вид?






Или другая определяемая в ходе ВЭЖХ величина - значение относительной чистоты (или относительного содержания) того или иного компонента. Для ее оценки мы сравниваем площадь пика этого компонента с суммарной площадью всех пиков.

Понимание философии

1. Во-первых, надо понимать, что протокол валидации - это документированное подтверждение надежности аналитической методики. 2. Кроме того, валидация метода анализа - обязательное условие при обеспечении контроля качества продукции. 3. Гарантия воспроизводимости: корректно проведенная валидация позволяет доверять получаемым в ходе ВЭЖХ результатом и способу обсчета этих результатов.

Статистическое обоснование валидности метода анализа

Стоит рассмотреть валидацию с двух точек зрения. Первая, теоретический аспект, нужна для понимания математического смысла процедуры валидации. Второй, соответственно, практический аспект - нужен для того, чтобы максимально эффективно и за наименьшее количество времени (и усилий) проводить расчет математической гипотезы.

Теоретический аспект:

- метод наименьших квадратов;
- распределения (нормальное, равномерное).

Практический аспект:

- использование современного ПО для ведения расчетов.

Метод наименьших квадратов

Задача - установление зависимости:

Y=f(X).

Величина Y определяет неточно, а с определенной погрешностью


а – неизвестные параметры эксперимента;
Pi – погрешности измерений

Наилучшие значения а, когда:


Решение методом наименьших квадратов подразумевает

1. Выдвинуть гипотезу о виде функции f(Xi, a1, a2,…ak). Она должна быть линейна относительно параметров



2. Определить численные оценки параметров, т.е. отыскать минимум функции



У линейной функции система дифференциальных уравнений является системой алгебраических уравнений. Решение системы уравнений.

3. Проверить выдвинутую гипотезу, вычислив критерий Фишера.



ss – сумма квадратов экспериментальных Yi и среднего Y;
ssresid – остаточная сумма

ssresid – остаточная сумма рассчитывается так:



Затем вычисленный F сравнивается с табличным F. Если табличный меньше, то модель адекватна.

4. Проверить выдвинутую гипотезу, определив к/т детерминированности.



→1 – модель адекватна;
→0 – модель не связана с экспериментом

Применение МНК в валидации метода анализа

• Определение диапазона линейности метода и калибровка метода.
• Статистическое подтверждение специфичности, точности, воспроизводимости метода и других величин.
• Сравнение единообразных методов.

Пример. Задача: Подтвердить воспроизводимость результатов ВЭЖХ-анализа концентрации рекомбинантного белка.



На этом примере можно пояснить

практический аспект

. А именно, использование современного программного обеспечения для решения гипотезы методом наименьших квадратов.

Использование линейного тренда при построении функции в Microsoft Excel 1. Занесение данных в лист Excel


2. Открытие Мастера диаграмм
(XY-точечная)


3. Добавить линию тренда




4. R2=0.9999
Модель адекватна


Использование линейного тренда при построении функции в Origin

1. Занесение данных в лист Origin


2. Построение графика
(scatter plot, например)


3. Создание линейного приближения:
Menu/
Analysis/
Fitting/
Fit Linear


4. Диалоговое окно Linear Fit
-свиток “Quantities to Compute”→
- Value, Standard Error, R-Square (COD) – пометить галочками


5. Отчет о модели включает:
R2=0,99986
Модель адекватна




Использование функции ЛИНЕЙН при построении зависимости в Microsoft Excel

1. Занесение данных в лист Excel

2. Выделить поле 5х2 и внести в строку формул:
=ЛИНЕЙН(все Y; все Х; ИСТИНА; ИСТИНА)
затем нажать
CTRL+SHIFT+ENTER


3. Получаем:
3.1. к/ты b=392.85
а=0.889,
3.2. их SD
3.3. R2=0.99986
3.4. F=21078.4
3.5. df=3 (степени свободы)


4. Для сравнения F с Fтабл. нужно знать Fтабл.
Для этого –
FРАСПОБР


5. FРАСПОБР
вероятность:
0,01
степени_свободы1:
5 (число экспериментов)
степени_свободы2:
3 (df в предыдущей таблице)


6. Получаем:
1. F=21078.4,
2. Fтабл=28.2371
F>Fтабл., т.е. модель адекватна


Использование функции ANOVA при построении зависимости в Origin

1. Создание линейного приближения:
Menu/
Analysis/
Fitting/
Fit Linear


2. Диалоговое окно Linear Fit
-свиток “Quantities to Compute”→
ANOVA – пометить галочкой
UCL – пометить галочкой (Confidence level сделать 99,9%)


3. Отчет о модели включает:
F=21078.39945
Prob>F=7.2051E-7
Prob-вероятность, она должна быть ниже р=(1-0,01UCL)
(р=0,01 в нашем случае)
Модель адекватна

Параметры валидации метода анализа

• Линейность (linearity)
• Точность (accuracy)
• Правильность (precision)
• Специфичность (specificity)
• Устойчивость (ruggedness)
• Предел обнаружения (limit of detection, LOD)
• Предел количественной оценки (limit of quantitation, LOQ)
  - нижний (low, LLOQ);
  - верхний (high, HLOQ)
  

Линейность

Определение:

Близость функционального описания зависимости определяемых величин от реальных значений к линейному виду.
Способность показать, что результаты теста сразу или после определенной математической обработки пропорциональны концентрации аналита в образце в пределах установленного интервала.

Задача:

Валидировать диапазон линейности при определении концентрации образца в пределах от 0,4 до 0,7 мг/мл

1. Раз рабочий диапазон метода анализа таков, то мы должны во время валидации РАСШИРИТЬ ДИАПАЗОН с учетом запаса в 20-50%.


2. Определять линейность функции мы должны, взяв несколько точек внутри этого диапазона. Логика подсказывает нам, что достаточно взять три точки, чтобы понять, линейна ли функция. Однако рекомендации FDA по валидации метода анализов (3-6 точек внутри диапазона) и европейского ВОЗ (ICH Q2b) (6-8 точек) с логикой не совпадают:



3. Следующий шаг. Сколько повторностей анализа проводить?



4. Проводим аналитические определения. В качестве примера получает следующие площади хроматографических пиков:



5. Анализ результатов методом НК



(А). A=(9945.6±96.03)+(40.48±47.45)C
(Б). R2=0,99879 (р менее 0,01)
(В). F=10725,74>Fтабл.
Гипотеза линейности верна!
Метод линеен в данном диапазоне!

(Г). Среднеквадратичное отклонение:



(Д). Отн. стандартное отклонение (к/т вариации, CV):



Задача:

Приведение к линейному виду
Валидировать диапазон линейности при калибровке определения Tr с помощью метода SEC (эксклюзионной ВЭЖХ)

SEC – хроматографический метод разделения молекул по размеру.



Для молекул трех различных молекулярных масс (в дальтонах), допустим, были получены следующие времена элюирования:



Тогда функциональная зависимость времени элюирования от массы может быть представлена следующим графиком:



Как видно, такая зависимость не линейна (линейность функции - не подтверждаемая коэффициентом детерминированности гипотеза)



Для линеаризации функцию необходимо представить в другом виде:
Tr=f(log(MW))



Выводы:
Определение диапазона, в котором функция может быть приведена к линейному виду. Анализ можно проводить ТОЛЬКО в этом диапазоне.
Валидация линейности – это демонстрация адекватности выбранной модели описания функции.

Резюме:
Валидация по параметру "линейность" включает:
Выбор диапазона
Модельное описание методом НК
Определение уравнения линейности (со стандартными отклонениями)
Проверка адекватности модели (R2, F)
Оценка среднеквадратичного отклонения и стандартного отклонения всей модели

Правильность

Определение:

близость получаемых результатов к истинному значению


Creal - реальная концентрация аналита в образце;
Canal - измеряемая в ходе метода анализа концентрация аналита в образце

Выбор способа определения правильности

1. Способ добавки	- Взвесить точную навеску контрольного образца - Растворить в жидкости, в трех концентрациях (3 точки концентраций: от 50% до 150% диапазона)
2. Способ смешения проб	- Смешать раствор с низкой концентрацией аналита и раствор с высокой концентрацией аналита → три точки концентраций
3. Референтный способ	- Проанализировать аналит с помощью уже валидированного, референтного метода. - Сравнить результаты текущего метода с результатами референтного
4. Способ с контролем	- Анализ аттестованных контрольных образцов (с заранее известным содержанием аналита)

Проведение анализа



Оценка правильности

Относительная систематическая погрешность, bias
- отклонение среднего измеряемого значения от реального





Критерий Лорда, L
- статистическая оценка достоверности
(по 10 параллельным определениям)



Итак, валидация правильности включает:
- Выбор точек внутри диапазона
- Оценка разброса систематических ошибок
- Оценка критерия Лорда для центральной точки / точек

Точность

Определение:

близость друг к другу результатов отдельных тестов, проведенных в одинаковых условиях (сходимость, или повторяемость) или выполненных в различных условиях (воспроизводимость), как-то: на различных приборах, различными аналитиками и т.д.

Точность и правильность:	Высокая правильность, но низкая точность (сходимость)
	Низкая правильность, но высокая точность (сходимость)
	Высокая сходимость, низкая воспроизводимость
	Высокая сходимость, высокая воспроизводимость! Но правильность все равно низкая:-(

Способ определения сходимости

- в одной лаборатории, одним аналитиком, на одном оборудовании за относительно короткий промежуток времени;
- 5-6 повторностей определений образца для каждой из трех концентраций;
- оценить коэффициент вариации (относительное стандартное отклонение) для каждой концентрации

Оценка сходимости

Относительное стандартное отклонение (коэффициент вариации), CV
- отношение среднеквадратичного отклонения от среднего значения; мера относительного разброса случайных величин

по матем.смыслу:



по физич.смыслу:







Способ определения воспроизводимости

- анализ в разных условиях: в разных лабораториях разными аналитиками, на разном оборудовании или в разное время (intra-day);
- 5-6 повторностей определений образца для каждой из трех концентраций;
- для intra-day: каждая серия опытов в течение 5 дней
- оценить коэффициент вариации (относительное стандартное отклонение) для каждой концентрации

Оценка воспроизводимости

Sxy, CV



Пример: определение СОЭ двумя методами

Метод (1): Sxy=1.0мм, Xср=10мм
Метод (2): Sxy=15мин, Xср=180мин

CV(1)=10% CV(2)=8,33%,
т.е. воспроизводимость метода (1) ниже.



Итак, валидация точности включает:
- Выбор точек внутри диапазона
- Оценка разброса коэффициентов вариации для выбранных точек

Предел обнаружения

Определение:

Минимальная концентрация аналита в образце, которая может быть обнаружена, но не определена количественно достоверно в условиях анализа.



Физический смысл:

Соотношение сигнал/шум методики



Геометрический смысл:





Определение сигма:

По стандартному отклонению холостой пробы (SD от фонового ответа);
По остаточному отклонению регрессионной линии, используя образцы аналита в предполагаемом диапазоне предела количественного определения;
По стандартному отклонению в точке пересечения с Y.

Проведение эксперимента:

- 3 точки диапазона концентраций;
- 5 повторностей определения для каждой точки

Пределы количественной оценки

Определение:

Минимальная концентрация аналита в образце, которая может быть количественно оценена с точностью не более 20% и правильностью 80-120%.

LLOQ – нижний предел количественной оценки
HLOQ – верхний предел количественной оценки

Проведение эксперимента:

- 3 точки диапазона концентраций;
- 5 повторностей определения для каждой точки;
- Или просто умножить LOD на 3

Специфичность

Определение:

Способность измерять точно и правильно аналит в присутствии компонентов, которые могут ожидаться в матрице образца.

Пример Будут ли Ваши определения аналита точны и правильны?
Площадь хроматографического пика: S=16458


А что, если это не один пик, а два, но неразрешенные друг относительно друга? То есть это пик не одного аналита, а двух?
Тогда и площадь не равна 16458?


Пики деформируются при низком разрешении и разделении R


Способ определения

-«загрязнить» аналит специфичными примесями

• Продукты деградации (при хранении) или агрегации;
• Системные примеси;

-в одной лаборатории, одним аналитиком, на одном оборудовании за относительно короткий промежуток времени;
-5-6 повторностей определений образца для каждой из трех концентраций;
-оценить коэффициент вариации и bias для каждой концентрации

Устойчивость

Определение:

Способность достоверно оценивать точность и правильность в нормальных условиях работы



Возможные отклонения условий:

-(1)- температура / заморозка-оттаивание образца;
-(2)- состав растворов (подвижной фазы);
-(3)- скорость потока / давление в системе / вязкость растворителя;
-(4)- и другие

Способ определения:

- Приготовить контрольный образец;
- Анализировать К.О., меняя те или иные условия (по 3-5 анализов в каждом условии);
- Оценить разброс значений результатов анализа (откликов) относительно среднего значения

Пример:
Определить устойчивость к изменению температуры хроматографической колонки в интервале от 28 до 32 градусов.

Порядок оформления работы

Создание и утверждение СОПа по валидации:

• Общие положения: цель, предмет, назначение валидации;
• Персонал, участвующий в процессе; распределение ответственности;
• Описание процедуры;
• Порядок регистрации данных;
• Порядок пересмотра данной процедуры

СОП: описание процедуры

- Определительная часть (описание параметров валидации и категорирование методик);
- Процедурная часть (содержание и процедура составления протокола и отчета о валидации);
- Регламентирующая часть (рекомендуемые значения критериев для валидационных параметров).

Создание валидационного протокола:

- Вводная часть (цель, предмет, ответственность и исполнители, список лит-ры, информационные материалы);
- Методическая часть (условия анализа, пробоподготовки, расчеты, статистическая обработка данных);
- Оценочная часть (критерии оценки, выводы, заключение, ревалидация).

Создание отчета о валидации:

Повторение Протокала, плюс
Маршрутная часть (лаб.журнал);
Расчетная часть (как и кем проводились расчеты, результаты расчетов);
Заключение и выводы.