2014年2月13日木曜日

小保方晴子の疑惑論文2(Nature Letter )

疑惑論文2: Nature Letter 
論文タイトル: "Bidirectional developmental potential in reprogrammed cells with acquired pluripotency"
Nature 505, 676–680 (30 January 2014) doi:10.1038/nature12969
著者: Haruko Obokata (小保方晴子), Yoshiki Sasai (笹井芳樹), Hitoshi Niwa (丹羽仁史), Mitsutaka Kadota (門田満隆), Munazah Andrabi, Nozomu Takata (高田望), Mikiko Tokoro 野老美紀子), Yukari Terashita (寺下愉加里), Shigenobu Yonemura (米村重信), Charles A Vacanti (チャールズ・バカンティ, Teruhiko Wakayama (若山照彦

http://www.nature.com/nature/journal/v505/n7485/full/nature12969.html

Fig1b最右画像とFig2g下画像の胎盤部分だけが、なぜか互いに類似しています。しかも2つの画像の実験条件は互いに異なっています。前者はSTAP細胞のキメラマウス、後者はFI-SCのキメラマウスの写真です。両画像の解像度が異なるためもあり、完全には一致しませんが、二つの画像は異なる実験によって得られたものとされているため、極めて高い類似性を示すことは不自然です。これほどの高い類似性は、不注意ミスであるにせよ、意図的(故意)であるにせよ、同サンプルが複数回撮影されて別目的に使いまわされた可能性や、同一画像の胎盤部分を画像編集加工し流用した可能性などを示唆しています。いずれにしろ、生データ(実験ノート、写真のデジタルデータ、データの作成日や改変日)などを調査しないかぎり、真相は明らかにならないでしょう。小保方晴子氏の学位取得申請に重要であったTissue Eng Part A(疑惑論文3)の実験画像においても、多数の類似性が認められており、加工(上下反転など)を行ったうえでの流用の可能性があったことも考慮すると、このNature Letterの論文の疑惑データについても、詳細な調査が求めらます。



疑惑画像5 ↓ Fig.1bと2gの胎盤画像を比較してください。高い類似性が確認できます。



朝日新聞の記事→ 共著者の山梨大学の若山照彦教授は、「同じマウスで角度が違う写真を2回使ってしまい、一方の削除を忘れた単純ミス」と説明した。若山教授はSTAP細胞を使いマウスを作製し撮影した。一つの胎児に対し向きを変えたりひっくり返したりして何枚も撮影。複数の胎児で計数百枚撮ったという。その結果、小保方さんが勘違いし同じ胎児の写真を使ってしまった。1人で追加実験をしながら図を作製するなど、忙しすぎたことも勘違いの要因の一つという。 加えて「論文を何度も書き直し、最終的に2枚目の写真は本文と関係がなくなっているが、削除を忘れた」と話している。(Nature誌記事における若山照彦教授のコメントも参考にしてください。)


疑惑画像6: Nature Letter論文のFig.1aの胎盤と羊膜のLong exposure(長時間露光)写真は、実際は通常露光写真と緑の蛍光強度が同じであることが判明し、長時間露光では無いのではないか?という疑われています。このバックグラウンドの緑蛍光が長時間露光でも変わっていないという問題は、PubPeerで指摘されています。 また、Fig.1bだけ胎盤の赤い自家蛍光が見えますね。一方、対照のFig.1aのESキメラの胎盤画像にはそのような赤い自家蛍光が見えません。また、胎児の緑の蛍光も、Fig.1aに比べ、Fig.2bが明るくなっています。つまり、両者でサンプルを準備するさいに、何かしらの人為的誤差があった可能性や撮影条件に違いがあった可能性もあり、両者を単純に比較することはできず、Fig.1bのSTAPキメラの胎盤・羊膜の緑蛍光も自家蛍光の可能性もあります。また、Fig.1aとFig.1bのLong exposureの画像は、胎児部分が除かれて胎盤と羊膜の部分だけが掲載されており、不自然という声が前々からあがっていました。論文内の記述によるとSTAPキメラは10匹作製され、そのうち6匹に胎盤、羊膜に緑の蛍光が認められたようですので、著者らはそれらの画像を全て公開し、疑惑を晴らすべきでしょう。




疑惑画像7: 

蛍光の漏れによる、偽陽性シグナルを取り除くため補正が必要です。
FACSの基本中の基本です。


疑惑画像?

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この論文については、下記アドレスのPubPeerサイトで議論してください。



Contributions

H.O. and Y.S. wrote the manuscript. H.O., Y.S., M.K., M.A., N.T., S.Y. and T.W. performed experiments, and M.T. and Y.T. assisted with H.O.’s experiments. H.O., Y.S., H.N., C.A.V. and T.W. designed the project.
なお、論文におけるContributionにおける記載内容から、
Mikiko Tokoro(野老美紀子)氏と、Yukari Terashita(寺下愉加里)氏が、小保方氏の実験補助をしていたと推測されます。


小保方晴子の疑惑論文3(Tissue Eng Part A誌 小保方第一著者)

疑惑論文3: Tissue Eng Part A 
(小保方晴子氏の学位取得申請において重要であった論文)
論文タイトル:  "The potential of stem cells in adult tissues representative of the three germ layers"
著者: Haruko Obokata (小保方晴子, Koji Kojima (小島宏司), Karen Westerman, Masayuki Yamato (大和雅之), Teruo Okano (岡野光夫), Satoshi Tsuneda (常田聡), Charles A Vacant (チャールズ・バカンティ, Tissue Eng Part A, 17 (2011)

Tissue Eng論文(学位業績)は、類似画像の多さからみて、うっかりミスによる貼り間違えなどという弁明は厳しいでしょう。これほどの多数の類似画像は、データ流用の故意性もしくは著者らのデータ管理の杜撰さ、研究内容の信頼性の低さを示唆しています。
東大医の小室氏(元千葉大医)らのように生データを紛失したとして真相をうやむやにし、プロトコルまで変えて再実験し、大量訂正するという逃れ方もできますが、いずにしろ、データ管理が不十分であると、誰も信用しなくなるでしょう。

なお、小保方晴子氏の学位取得に重要であった"Tissue Eng Part A"の論文のデータ流用疑惑については、この研究に科学研究費が使用されているようなので、文部科学省(日本学術振興会)や早稲田大学へ、制度に度づいて、調査を要求することができます

 → 
(再生医療本格化の為の上皮細胞を中心とした新規組織工学技術の開発 Research Project Number:08J05089)

類似画像8:
Fig.2のFgf5のバンド画像と、Fig.3のNat1のバンド画像が類似しており、データの流用が疑われます。


類似画像9: 
Fig.3のKlf4のバンド画像を上下反転させると、Fig.3のCriptoのバンドがに類似します。また、これらの画像の左から1列目と2列目のバンド画像は、Fig.4のNat1のバンドとも類似しています。上下反転という操作や、3つの実験画像にわたる類似性から、故意によるデータの流用が疑われています。



















類似画像10: Fig.2のKlf4の左から1,2列目のバンド画像が、Fig.3のSox2の左から3,4列目のバンド画像と類似しており、データの流用が疑われています。












追記(2014年02月18日):2014年02月18日の朝日新聞報道によると、早大広報室は「仮に問題の画像が取り消されたとしても、博士論文の趣旨に影響しないと考えている」と発表したとあります。このような「データ流用はあったが論文の結論には影響しない」という趣旨のコメントを、研究不正を調査する立場にある研究機関(早稲田大学)が、調査着手前から、発表したのは異常です。これは調査機関自体が問題や不正を隠蔽する方向に動いていることを示唆しています。早稲田大は、生データを検証したり本人への聞取り調査もせずに、なぜ論文の趣旨に影響しないといえるのでしょうか?少なくとも4つの実験画像に亘ってデータ流用が認められる以上、意図的に行われた可能性や杜撰なデータ管理が推測され、論文の結論やその他データの信頼性も低いのです。

類似画像11: 
小保方晴子氏が第一著者のTissue Eng Part A誌論文のFig.1のFは、小保方晴子氏の博士論文のFig.6のFの画像と、互いに上下反転の関係にあります。不適切なデータ改ざんが疑われます。

↓ Tissue Eng Part A誌論文のFig.1




↓ 博士論文のFig.6



この論文については、下記アドレスのPubPeerサイトで議論してください。
https://pubpeer.com/publications/20883115

小保方晴子の疑惑論文4(Nature Protocol誌)

論文タイトル: "Reproducible subcutaneous transplantation of cell sheets into recipient mice"
著者: Haruko Obokata (小保方晴子, Masayuki Yamato, (大和雅之), Satoshi Tsuneda (常田聡), Teruo Okano (岡野光夫, Nat Protoc, 6 (2011)
http://www.nature.com/nprot/journal/v6/n7/full/nprot.2011.356.html

小保方晴子氏の2011年のNature Protocol誌の論文は、(株)セルシード社の製品の細胞シートの性能に関するものでした。そして、論文の共著者である東京女子医大の岡野光夫教授や大和雅之教授は(株)セルシードの関係者であり、特に、岡野光夫教授は、有価証券報告書ではこの時点で同社株の大量保有者かつ役員でした(株式会社セルシード(E24158)の有価証券報告書(S0008294)によると東京女子医大の岡野光夫教授は2010年12月31日の時点で、当社株式138,000株と新株予約権1,010個を所有している)。このように、金銭的利益相反問題が存在するにも関わらず、このNature Protocol誌の論文には、”金銭的利益相反は無い(The authors declare no competing financial interests.)”と宣言していました。これらの虚偽記載もまた、彼女らの信用を大きく損なう結果となりました。
 詳細は、利益相反事項の未記載問題を参照してください。


この論文については、下記アドレスのPubPeerサイトで議論してください。

小保方晴子の疑惑論文5(Tissue Eng Part A誌 小保方第二著者)

Tissue Eng Part A. 2011 Jun;17(11-12):1507-15. doi: 10.1089/ten.TEA.2010.0470. Epub 2011 Apr 12.

Development of osteogenic cell sheets for bone tissue engineering applications.

Pirraco RP1, Obokata H (小保方晴子, Iwata T, Marques AP, Tsuneda S, Yamato M (大和雅之, Reis RL, Okano T (岡野光夫.
  • 1Institute of Advanced Biomedical Engineering and Science, Tokyo Women's Medical University, Tokyo, Japan.

東京女子医大の岡野光夫教授が責任著者の上記のTISSUE ENGINEERING誌論文(小保方晴子氏は第二著者)はセルシード社の関連の深い細胞シートに関する研究の報告をしています。
そして、論文出版当時、岡野教授はセルシード社大株主で役員でした。
しかしながら、岡野光夫教授らは論文中において、これらの事実に反して、金銭的利益相反を否定しています。
具体的に説明すると、Tissue Eng Part A誌( 17(11-12), 1507-1515.)論文中の "Disclosure Statement"の項目に、 "No competing financial interests exist." との虚偽記載があります。

なお、セルシード社ホームページのBone marrow stromal cells(骨髄間質細胞)の項でも、このTissue Eng Part A誌( 17(11-12), 1507-1515.)の論文は紹介されています。

、 

利益相反事項の隠蔽問題


利益相反問題1
 小保方晴子氏の2011年のNature Protocol誌の論文は、(株)セルシード社の製品の細胞シートの性能に関するものでした。そして、論文の共著者である東京女子医大の岡野光夫教授や大和雅之教授は(株)セルシードの関係者であり、特に、岡野光夫教授は、有価証券報告書ではこの時点で同社株の大量保有者かつ役員でした(株式会社セルシード(E24158)の有価証券報告書(S0008294)によると東京女子医大の岡野光夫教授は2010年12月31日の時点で、当社株式138,000株と新株予約権1,010個を所有している)。このように、金銭的利益相反問題が存在するにも関わらず、このNature Protocol誌の論文には、”金銭的利益相反は無い(The authors declare no competing financial interests.)”と宣言していました。これらの虚偽記載もまた、彼女らの信用を大きく損なう結果となりました。
 ノバルティスのディオバン臨床研究不正事件でも問題になりましたが、このような利益相反事項(論文出版により金銭的利益を得たり失ったりする可能性のある企業の社債や株の保有など)は、論文投稿の際に開示するべきとされています。特にNature Publishing はこの点に厳しく、その規定(Nature journals' competing financial interests policy)で、投稿する際には、投稿論文に利益相反があるのか無いのか、明記することを義務付けています。

↓ Nature Protocolの論文より引用 
Competing financial interests The authors declare no competing financial interests.

以下の3項目は、Natureの規定で、"金銭的利益相反(Competing financial interests)"として定義された具体的項目です。
1) Funding: Research support (including salaries, equipment, supplies, reimbursement for attending symposia, and other expenses) by organizations that may gain or lose financially through this publication.
2) Employment: Recent (while engaged in the research project), present or anticipated employment by any organization that may gain or lose financially through this publication.
3) Personal financial interests: Stocks or shares in companies that may gain or lose financially through publication; consultation fees or other forms of remuneration from organizations that may gain or lose financially; patents or patent applications whose value may be affected by publication.
(日本語訳)
1) 研究資金: 論文出版により利益を得たり失ったりする可能性のある組織(団体)からの研究補助(給与、装置、備品、シンポジウム出席のための支援、その他の経費)
2) 雇用: 論文出版により利益を得たり失ったりする可能性のある企業によって、最近(研究プロジェクトに従事している間)、現在、あるいは将来的に雇用されること
3) 個人的な金銭的利益: 論文出版により金銭的利益を得たり失ったりする可能性のある企業の社債や株、金銭的利益を得たり失ったりする可能性のあるコンサルタント費やその他の報酬、論文出版によってその価値が影響を受ける可能性のある特許、または特許申請。


利益相反問題2
Tissue Eng Part A. 2011 Jun;17(11-12):1507-15. doi: 10.1089/ten.TEA.2010.0470. Epub 2011 Apr 12.

Development of osteogenic cell sheets for bone tissue engineering applications.

Pirraco RP1, Obokata H (小保方晴子, Iwata T, Marques AP, Tsuneda S, Yamato M (大和雅之, Reis RL, Okano T (岡野光夫.
  • 1Institute of Advanced Biomedical Engineering and Science, Tokyo Women's Medical University, Tokyo, Japan.

東京女子医大の岡野光夫教授が責任著者の上記のTISSUE ENGINEERING誌論文(小保方晴子氏は第二著者)はセルシード社の関連の深い細胞シートに関する研究の報告をしています。
そして、論文出版当時、岡野教授はセルシード社大株主で役員でした。
しかしながら、岡野光夫教授らは論文中において、これらの事実に反して、金銭的利益相反を否定しています。
具体的に説明すると、Tissue Eng Part A誌( 17(11-12), 1507-1515.)論文中の "Disclosure Statement"の項目に、 "No competing financial interests exist." との虚偽記載があります。

なお、セルシード社ホームページのBone marrow stromal cells(骨髄間質細胞)の項でも、このTissue Eng Part A誌( 17(11-12), 1507-1515.)の論文は紹介されています。


利益相反問題3
 小保方晴子氏ら理研、チャールズ・バカンティ教授らのハーバード大学医学部ブリガム&ウィメンズ病院、大和雅之氏の東京女子医科大学は、共同で、STAP細胞に関わる国際特許(WIPO Pub. No.: WO/2013/163296:HTMLPDF)を出願しています。
  問題1で述べたように、特に、Natureグループの雑誌では、このような利益相反事項(論文掲載の可否によって価値が変わるような特許を出願している場合など)は、論文投稿の際に開示する義務があります。 
 しかしながら、小保方晴子氏らは、下記のように、Nature Articleの論文疑惑論文1)において、"金銭的利益相反(Competing financial interests)は無し"と明記しているのです。小保方氏らは、Natureが定義している”Personal financial interests(個人的な金銭的利益)”の項目に違反しています。一方、「職務発明の対価は法人が決めるので、本件は、Natureの規約の"個人の金銭的利益(Personal financial interests)"には該当しない」と擁護する意見もあります。しかしながら、東大理学部教授のRobert Geller氏は、「例えば投稿時に編者にそう説明したて編者がそれを認めたら問題ないですが、いまそれを言うなら詭弁でしょうね。」と述べています。
  
↓ Nature Articleの論文より引用 
Competing financial interests
The authors declare no competing financial interests.



以下、関連するツイートを参照してください。





STAP細胞作製の再現性について

STAP細胞作製の再現性について
小保方氏が発表したSTAP細胞の作製には、Nature論文の共著者で共同研究者の若山照彦教授とその弟子(student)が、小保方氏指導のもとでの理研の実験では再現に成功していますが、若山教授が山梨大学のラボに移った後では未だ再現に成功していないことが判明していますNature誌記事より)

カリフォルニア大学の幹細胞研究者ポール・ネフラー博士が運営しているSTAP細胞作製の再現性確認実験の結果を報告しあうためのブログ記事(Knoepfler Lab Stem Cell Blog) では、まだ再現に成功したという報告はありません。
小保方晴子の論文では「生後7日新生児マウス」由来の細胞によってSTAP細胞を確立されていますが、現時点で上記サイトに報告されている追試では新生児マウスの細胞を用いているのはありません(生物種未記載にはある) 。よって、現時点で再現性がないと断定することはできません。

現在の追試報告例(10例):未だ、再現成功例無し。
Ethan: 失敗、細胞腫への言及なし 
Ruben Rodriguez: 失敗、「ヒト」新生児繊維芽細胞使用 
Elliott Schwartz: 失敗、「ヒト」繊維芽細胞 
Subhash Kulkarni: 失敗、新生児全血、成体全血 
Sasha: 失敗、マウス胎仔繊維芽細胞、マウス成体神経幹細胞、マウス胎児神経幹細胞 
Hong: 失敗、マウスES細胞 
Yoshiyuki Seki: 失敗、マウス胎仔繊維芽細胞 
Andres: 失敗、「ヒト」胎仔繊維芽細胞 
Dr. Pierre Debs: 微妙、成体ラット・マウス脾臓細胞 

Ray and Sandy:  失敗、MEF(マウス胎児芽繊維細胞)





参考となるツイート

https://twitter.com/jseita/status/435516762390413312
Jun Seita ‏@jseita
本家の実験でもwt miceの細胞と平行して実験してないから、自家蛍光なのかGFP signalなのか、区別できてないじゃん。。。orz

https://twitter.com/jseita/status/435517921079468032
Jun Seita ‏@jseita
Online onlyのmaterials & methodsからカタログ番号たどってったらanti-CD34 conjugated with PE、らしいけど、これGFPと一緒に使えないじゃん!!!


RNAseqとChiPseqのデータの未登録問題

小保方晴子氏のSTAP細胞に関するNature Letter論文疑惑論文1)には、RNAseqとChiPseqの実験データに関してNCBI BioSample databases用のアクセスIDを下記のように記載していたが、実際は、SRAやGEOなどのデータベースには登録されていなかったことが判明し、問題となっている(2014年2月12日)。

↓ 論文中における記述
"RNA-seq and ChIP-seq files have been submitted to the NCBI BioSample databases under accessions SAMN02393426, SAMN02393427, SAMN02393428, SAMN02393429, SAMN02393430, SAMN02393431, SAMN02393432, SAMN02393433, SAMN02393434 and SAMN02393435."

ネイチャーの規定では、論文を出版する際には、このような関連データを適切なデータベースに載せておかなければならないという義務がある。
ネイチャーに問い合わせをした人物によると、ネイチャーは既にこの問題に気づいており、著者(小保方ら)に連絡を入れたらしいが、著者から返答があったかどうかについてはわかっていない。


追記(2014年2月21日):米国時間で2014年2月19-20日頃にデータがようやく追加されたようです。