世界変動展望

STAP細胞で有名になった理化学研究所の小保方晴子（その他）の研究疑義を紹介。

☆1 Obokata H, et.al.:"The potential of stem cells in adult tissues representative of the three germ layers." Tissue Eng Part A. 2011 Mar;17(5-6):607-15. doi: 10.1089/ten.TEA.2010.0385. Epub 2011 Jan 10.

に関する指摘。なお、小保方の博士論文概要の5ページ目にある研究業績書No.1報文（2）をみるとこの論文が記載されている。この論文は小保方の博士論文の成果の一部。

（１−１）異なる条件の実験画像が類似しておりデータ流用が疑われる。また同じ画像を3回流用していること、半分だけ切り貼りして使っていること、上下反転という偽装加工が含まれることから故意の流用が疑われる。

画像1、作成者　世界変動展望 著者

（１−２）異なる条件の実験画像が類似しておりデータ流用が疑われます。

画像2（参考）　作成者　世界変動展望 著者

（2014.2.24）
（１−３）異なる条件の実験画像が類似しておりデータ流用が疑われます。

画像1-3、作成者及び指摘者11jigen。

☆2 Haruko Obokata, et.al.:"Stimulus-triggered fate conversion of somatic cells into pluripotency" Nature 505, 641–647 (30 January 2014) 、doi:10.1038/nature12968 PDF、写し。

に関する指摘。これはSTAP細胞論文のArticleです。

（２−１）第3レーンの両側に不自然な直線があります。背景画像も連続していません。これは明らかに異なる画像を貼り付けて作成したものです。不都合なデータを差し替えた可能性があるので生データの精査が必要です。また下の画像は貼りつけ部分に明確な境界線がなく、説明もないので、それらの明示を要求したNature誌の画像規定に違反している可能性があります（参考）。

→（中間報告）切り貼りを認めました。第3レーンはコントラストを変更し、第1,2,4,5レーンは縦に伸ばす操作をしたことも認めました。調査継続中。

画像3　（[2]、参考）　画像はわかりやすくするため色等の変更あり。
説明画像作成者　世界変動展望 著者、画像自体の作成者はPubPeer投稿者。

（2014.2.23）
（２−２）（この部分は最初から画像2-2の部分まで11jigen作成の疑惑画像3の引用、ただし画像2-2部分にキャプション追加）図3bのコントロール（未刺激）細胞のOct4-GFP（緑色）の蛍光顕微鏡写真（左下）の下部中央に、なぜか赤い細胞が存在し、ネガコン（陰性対照）画像として不適切という疑惑が浮上しています。

画像2-2、作成者11jigen

画像2-2-1、作成者　世界変動展望 著者
私の画像ソフトでは明るさ＋39、コントラスト＋98

左側だけ全体的に赤色の画像になるので、左のコントロール（未刺激）細胞だけ赤のフィルターを通した画像だと推測される。Oct4-GFPの緑色蛍光を消すためなのか・・・意図は不明。画像を誤って載せた可能性もあります。しかし、Oct4-GFPが発現していない証拠にはなりません。

New！（2014.2.26）（2014.3.1加筆）
（２−３）この論文は引用元の明示なく他者の論文の文章を使用しています。これは盗用を示唆しますが引用元を書き忘れた可能性もあります。赤色が重複部分。

→（中間報告）他論文からの写しであることを認めました。調査継続中。

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Nature Article（☆2）

Karyotype analysis

Karyotype analysis was performed by Multicolor FISH analysis (M-FISH). Subconfluent STAP stem cells were arrested in metaphase by colcemid (final concentration 0.270 µg ml−1) to the culture medium for 2.5 h at 37 °C in 5% CO2. Cells were washed with PBS, treated with trypsin and EDTA (EDTA), re-suspended into cell medium and centrifuged for 5 min at 1,200 r.p.m. To the cell pellet in 3 ml of PBS, 7 ml of a pre-warmed hypotonic 0.0375 M KC1 solution was added. Cells were incubated for 20 min at 37 °C. Cells were centrifuged for 5 min at 1,200 r.p.m. and the pellet was re-suspended in 3–5 ml of 0.0375 M KC1 solution. The cells were fixed with methanol/acetic acid (3:1; vol/vol) by gently pipetting. Fixation was performed four times before spreading the cells on glass slides. For the FISH procedure, mouse chromosome-specific painting probes were combinatorially labelled using seven different fluorochromes and hybridized as previously described⁴¹. For each cell line, 9–15 metaphase spreads were acquired by using a Leica DM RXA RF8 epifluorescence microscope (Leica Mikrosysteme GmbH) equipped with a Sensys CCD camera (Photometrics). Camera and microscope were controlled by the Leica Q-FISH software (Leica Microsystems). Metaphase spreads were processed on the basis of the Leica MCK software and presented as multicolour karyograms.

引用元、

Jianli Guo, et al.:"Multicolor karyotype analyses of mouse embryonic stem cells" In Vitro Cellular & Developmental Biology - Animal
SEPTEMBER and OCTOBER 2005, Volume 41, Issue 8-9, pp 278-283

Materials and Methods

Chromosome preparation
Metaphase spreads of the ES cells were performed as follows. Subconfluent ES cells were arrested in metaphase by adding colcemid (final concentration 0.270 μg/ml) to the culture medium for 2.5 h at 37° C in 5% CO₂. Cells were washed with PBS, treated with trypsin-ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), resuspended into cell medium and centrifuged for 5 min at 1200 rpm. To the cell pellet in 3 ml of PBS, 7 ml of a prewarmed hypotonic 0.0375 M KCl solution was added. Cells were incubated for 20 min at 37° C. Cells were centrifuged for 5 min at 1200 rpm and the pellet was resuspended in 3–5 ml of 0.0375 M KCl solution. The cells were fixed with methanol/acetic acid (3:1, vol:vol) by gently pipetting. Fixation was performed four times prior to spreading the cells on glass slides.

Multicolor FISH analysis (M-FISH)
For M-FISH analysis mouse chromosome–specific painting probes were combinatorially labeled using seven different fluorochromes and hybridized as previously described (Jentsch et al., 2003). For each cell line 9–15 metaphase spreads were acquired by using a Leica DM RXA RF8 epifluorescence microscope (Leica Mikrosysteme GmbH, Bensheim, Germany) equipped with a Sensys CCD camera (Photometrics, Tucson, AZ). Camera and microscope were controlled by the Leica Q-FISH software (Leica MicrosystemsImaging solutions, Cambridge, United Kingdom). Metaphase spreads were processed on the basis of the Leica MCK software and presented as multicolor karyograms.

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引用元とNature論文を比べるとethylenediaminetetraacetic acidの略であるEDTAをEDTA（EDTA）と連続させたり、KClをKC1と無意味な言葉に変換しています。機械的方法でコピペしたからでしょうか？なぜこのようなことが起きたのかは不明です。

またNature論文と引用元はライカ社（Leica Mikrosysteme GmbH）の DM RXA RF8 落射蛍光顕微鏡（epifluorescence microscope ）と、フォトメトリクス社 (Photometrics)の Sensys CCD カメラの実験機器名が共通しており、小保方らは実験器具まで引用元と同じものを使ったのか？それは本当に可能か？小保方が研究室を立ち上げた時にはこれらを入手するのは困難では？論文の記述どおりにKaryotype analysisの実験を行わなかったのでは？という疑義も指摘されています。引用元と比較するとNature論文は実験器具メーカーの所在地や国名をなぜか削除しています。

野依良治理研理事長は「参考にした文献を故意に引用しない、他の著者の論文から表現の一部を借りながら自分のものとして発表する」ことは剽窃であり許されず科学に対する裏切りだと厳しく戒めています。

なお、同様の剽窃がC.A.Vacanti、小保方晴子らの特許でも確認できます。引用元の明示はありません。引用元との重複を赤で示します。KC1という誤記があり、引用元の論文ではimagingという単語が特許においてはhangingと間違った単語に変わっています。

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Vacanti,小保方らの特許、

Generating pluripotent cells de novo WO 2013163296 A1、

[00290] Karyotype analysis. Karyotype analysis was performed by Multicolor FISH analysis (M-FISH). Subconfluent STAPS cells were arrested in metaphase by colcemid (final concentration 0.270 μg/ml) to the culture medium for 2.5 h at 37°C in 5% CO2. Cells were washed with PBS, treated with trypsin/ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), resuspended into cell medium and centrifuged for 5 min at 1200 rpm. To the cell pellet in 3 ml of PBS, 7 ml of a prewarmed hypotonic 0.0375 M KC1 solution was added. Cells were incubated for 20 min at 37°C. Cells were centrifuged for 5 min at 1200 rpm and the pellet was resuspended in 3-5 ml of 0.0375 M KC1 solution. The cells were fixed with methanol/acetic acid (3: 1; vol/vol) by gently pipetting. Fixation was performed four times prior to spreading the cells on glass slides. For the FISH procedure, mouse chromosome-specific painting probes were combinatorially labeled using seven different fluorochromes and hybridized as previously described (Jentsch et al, 2003). For each cell line, 9-15 metaphase spreads were acquired by using a Leica DM RXA RF8 epifluorescence microscope (Leica Mikrosysteme GmbH, Bensheim, Germany) equipped with a Sensys CCD camera (Photometries, Tucson, AZ). Camera and microscope were controlled by the Leica Q-FISH software (Leica Microsystems hangingsolutions, Cambridge, United Kingdom). Metaphase spreads were processed on the basis of the Leica MCK software and presented as multicolor karyograms.

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（２−３）の部分は11jigenのまとめブログを参考にしました（写し）。

New！（2014.3.5）
（２−４）この論文は引用元の明示なく他者の論文の文章を使用しています。これは剽窃を示唆しますが引用元を書き忘れた可能性もあります。赤色が重複部分。「2006年にMerck Milliporeに買収されたChemicon社のURLや同社の古い試薬名（CpGenome DNA modification kit）までコピペしていたことが指摘されています。この試薬を使ったDNAメチル化の評価実験は、実際には行われていなかったのではないか？と疑われています。」（リンク先からの引用）

→（調査結果）この部分は必然的によく似た記述になり剽窃でないとしました。試薬名の件は言及されず。

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Nature Article（☆2）

Bisulphite sequencing
GFP-positive cells in STAP clusters were collected by FACS Aria. Genomic DNA was extracted from STAP cells and analysed. Bisulphite treatment of DNA was performed using the CpGenome DNA modification kit (Chemicon, http://www.chemicon.com), following the manufacturer’s instructions. The resulting modified DNA was amplified by nested PCR using two forward (F) primers and one reverse (R) primer: Oct4 (F1, 5′-GTTGTTTTGTTTTGGTTTTGGATAT-3′; F2, 5′-ATGGGTTGAAATATTGGGTTTATTTA-3′; R, 5′-CCACCCTCTAACCTTAACCTCTAAC-3′). And Nanog (F1, 5′-GAGGATGTTTTTTAAGTTTTTTTT-3′; F2, 5′-AATGTTTATGGTGGATTTTGTAGGT-3′; R, 5′-CCCACACTCATATCAATATAATAAC-3′). PCR was done using TaKaKa Ex Taq Hot Start Version (RR030A). DNA sequencing was performed using a M13 primer at the Genome Resource and Analysis Unit, RIKEN CDB.

引用元、

Stem Cells. 2006 Sep;24(9):2007-13. Epub 2006 May 18.

Northern and Bisulfite Sequencing

☆3 Haruko Obokata, et al.:"Bidirectional developmental potential in reprogrammed cells with acquired pluripotency"  Nature 505, 676–680 (30 January 2014) doi:10.1038/nature12969　PDF、写し。

に関する指摘。これはSTAP細胞論文のLetterです。

（３−１）Figure1bはSTAP細胞のキメラ、Figure 2gはFI-SCのキメラ。しかし胎盤画像が類似しています。これは同じ個体の異なる2枚の画像のうち一方を別な個体の画像として使用した可能性を示します。

→（調査結果）同じ個体の異なる2枚の画像だと認めました。しかし一方を削除し忘れたミスと結論。

画像4、11jigenの指摘と訂正、写し - 2014.2.14 閲覧
（注）　上の図は2014-02-14 01:27:11のコメントによる訂正済み
上の図の作成者は11jigen、下の図の作成者は片瀬久美子（補足、補足2、写し1、写し2、写し3）。片瀬の作成図の引用は本人から問題ない旨の言及があった。

New！（2014.2.28）
（３−２）Figure1aの胎盤等の画像は通常露光と長時間露光（Long Exposure）の緑色強度が同じであり、どちらも同じ露光画像ではないかと指摘されています。

画像3-2、画像作成者と指摘者はPubPeer投稿者。
論文の著者名等やFigure1の言葉を追加したのは著者

☆4 Haruko Obokata:"Isolation of pluripotent adult stem cells discovered from tissues derived from all three germ layers"（三胚葉由来組織に共通した万能性体性幹細胞の探索）　Doctor thesis February 2011 Waseda University

→小保方は訂正されていない下書きを製本したと弁明。

New！（2014.3.11）
（４−1）博士論文のBackgroudの部分の文章のほとんどをNIHの文章（一部写し）から剽窃。引用元の明記なし。両者の比較を参照（水色枠内が違う部分）。全108ページ中約20ページを剽窃。

New！（2014.3.12）
（４−２）第2,3,4,5章のレファレンスも剽窃。「各章の本文自体にはReference番号が一つもなく、どの文章がどの論文を引用しているのか全く不明」（リンク元からの引用、問題2）で「博士論文の本文とは一つ一つ対応していないと考えられます。」（リンク元からの引用、問題2）「第３章のReferencesは、コピペ操作によりページ範囲が文字化けし、盗用元と同じくABC順になってしまっている」（リンク元からの引用、問題2）。博士論文2〜5章のレファレンス。

New！（2014.3.12）
（４−３）Figure8とFigure16の画像に上下反転があり、多数流用されている。故意の改ざんが疑われる。リンク先の問題5を参照。

New！（2014.3.13）
（４−３）他にも続々と捏造や剽窃の疑いが浮上しています。

☆その他未解決

・岡川梓（Azusa Okagawa）国立環境研究所研究員らの件（未解決）

・立石幸代（Yukiyo Tateishi）元国立環境研究所ポスドク、柳澤純（Junn Yanagisawa）筑波大教授らの件（もうすぐ調査結果が出る）

・岡山大学医学部の件（未解決、未調査）

・野口隆之（Takayuki Noguchi）大分大学教授らの件（未解決、調査中）

・高井教行（Noriyuki Takai）大分大元講師の件（未解決、調査中）

（続く）