世界の人類の半数を失った未曽有の大災害「セカンド・インパクト」の後、海は赤く染まり、人々は「使徒」と呼ばれる謎の生命体の脅威にさらされていた。碇シンジ（緒方恵美）は、国連直属の特殊機関「NERV（ネルフ）」の汎用ヒト型決戦兵器エヴァンゲリオン初号機のパイロットに選び出され、同じく零号機パイロットの綾波レイ（林原めぐみ）とともに使徒との戦いに明け暮れていた。
ある時、使徒が北極に出現。エヴァンゲリオン仮設５号機に乗った真希波・マリ・イラストリアス（坂本真綾）が出撃し使徒を撃破するが、５号機も“予定通り”大破してしまった。
同じ頃。母の墓参りから帰宅中のシンジとNERVの戦闘司令官・ミサト（三石琴乃）の前に、新たな使徒が現れた。動揺する２人が目にしたのは、空から放たれた鮮やかな赤のエヴァンゲリオン２号機。派手な戦いぶりを見せた２号機に搭乗していたのは、式波・アスカ・ラングレー（宮村優子）。彼女は、シンジとともにミサトの家に同居することになる。言いたいことをポンポンと言い放つアスカの登場にシンジはタジタジ。他人には興味のないレイに対しても遠慮を知らないアスカの存在は、レイにも少しずつ影響を与えていく。
そんな中、NERVの本部を狙う新たな使徒が襲来。変幻自在で次に現れる場所が予測不能の使徒に対して一瞬の迷いも許されない状況下で、ミサトは独断でエヴァ３体を連携させる作戦に出る。初めての事態に自分のペースがつかめず戸惑うアスカの２号機。そんなアスカをフォローしながら使徒を全身で食い止めるシンジの初号機。使徒のパワーに初号機が苦戦する中、レイの零号機が捨て身の覚悟で飛び出し、作戦は無事成功。パイロットの３人はそれぞれに傷つきながらも、互いへの理解を深めていった。
その後しばらく使徒の襲来は途絶え、平凡な学園生活が戻ってきた。そんなある日、屋上でぼんやりしているシンジの「上」に、一人の女の子が舞い降りてくる。日本に極秘入国したらしいその女の子・マリは、このことは極秘に、と一方的に告げて去っていった。一方、穏やかな生活の中で人間らしい感情を取り戻しつつあるレイは、普段のお礼の意味を込めてゲンドウとシンジの仲を取り持つ食事会を企画。自分の手で食事を作って、ゲンドウとシンジをもてなそうというのだ。その計画のために、レイは秘密で料理の練習をし始める。
平和な日々が永遠に続くかと思われた矢先、突然消失するエヴァ４号機。パイロットの安全を確保するために、NERVでは人を乗せずにエヴァを動かすことができる「ダミーシステム」が開発され、実戦投入に向けたテストが重ねられていた。そして、アメリカからエヴァ３号機が日本に送られ、２号機は封印されることになる。紆余曲折を経て、３号機のパイロットにはアスカが選ばれた。エヴァンゲリオンだけが自分の居場所だと語るアスカにとって２号機の封印は耐えがたいものだったが、結局３号機にテスト搭乗することに同意する。
レイがゲンドウとシンジを招いた食事会の当日。新たな気持ちで３号機に乗り込むアスカだったが、３号機は使徒によって浸食されていた。暴走し始める３号機。ゲンドウの命令によりシンジは出撃するが、使徒がアスカを乗せたエヴァだと知り、戦いを拒否する。遂にゲンドウはダミーシステムを使って戦うことを選択。初号機はシンジを乗せたまま彼の意思を無視して使徒せん滅のために戦い始める…。
金輪際エヴァに乗りたくないと、第三新東京市を離れることにするシンジ。しかし、使徒の攻撃が終わったわけではない。シンジは本当にこのまま「逃げて」しまうのか？ レイとアスカ、そしてマリの運命は…？