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『人工細菌誕生』の論文を解説してみる：その２（Mmゲノムの人工合成）

Biology

これから2回のエントリで，実際に行われた実験内容と結果について解説します．専門的な内容が続き，つまらないかもしれませんが，実験内容の理解なくして，意義の理解はありえないので，ご容赦ください．

研究に使った細菌

　この研究には，2種類の細菌が登場する．

1. Mycoplasma mycoides（以下Mmと略す）
   • マイコプラズマ・マイコイデス．マイコプラズマ属の細菌の1種．MmゲノムDNAを人工合成して移植した．wikipedia:マイコプラズマ
2. Mycoplasma capricolum（以下Mcと略す）
   • マイコプラズマ・カプリコラム．マイコプラズマ属の細菌の1種．Mmの近縁種．MmゲノムDNAの移植先．

　マイコプラズマ属は，数ある細菌の中でもゲノムサイズがとても小さい，つまりDNA全体の長さが短いことで知られている．ゲノムを人工合成・組立てする際に，合成するDNAがなるべく短い方が実験難易度が下がるため，今回の研究ではMm，Mcの２種類が選ばれた．2008年の論文では，ゲノムサイズが世界最小の細菌であるM. genitaliumが使われていたが，この細菌は増殖が遅く，実験を行う上で時間がかかるため，より増殖の速いMmが使われることになった．

　差し当たっては，「Mm = ゲノムのドナー（提供者），Mc = レシピエント（移植先）」ということを覚えておけば，これからの話を理解するには十分である．

研究の流れ１：Mmゲノムの人工合成

図1．Mmゲノムを人工合成する4ステップ

　前提として，MmゲノムのDNA配列は既に解析され，全体の配列が決定されていた．

　Mmゲノムの長さは約100万 bp*1（1 Mbp）．ヒトゲノム（30億 bp）と比べたら小さいが，通常の生物学実験で扱うDNAとしてはとても長い．当然，一気にMmゲノムを人工合成することはできない．そのため，4ステップ：1k → 10k → 100k → 1Mbpという順に部分合成し，Mmゲノム全体を作り出した（図1）．

Step 1: DNAカセット（1 kbp）の合成

　まず，コンピュータ上にあるMmゲノムの配列データを基に，1 Mbpのゲノム全体を約1 kbp x 1000個のフラグメント（カセット）に分割した（図1）．

　次に，このMm DNAカセットを化学合成した*2．

Step 2: 10 kbp中間体の合成

図2. 1 kbpから10 kbpの中間体を作る

　それぞれのMm DNAカセットの両端は，隣接するカセットとオーバーラップするように作られている（図2A）．1000種類のカセットそれぞれをベクターと呼ばれる実験用のDNAと繋げ，環状DNA（プラスミド）を作った*3．

　次に，このカセットが載ったプラスミドの中でDNAの位置が連続するものを，10種類まとめて酵母の中に導入した．酵母の中でオーバーラップ領域が組換えられることで，DNAカセットは順番通りに繋がっていく（図2B）．こうして10個のカセットが繋がった10 kbpの中間体100種類を得た*4（図2C）．得られた中間体のDNA配列が正しいことは，100種類全てについてDNA配列を読むことで確かめた．

Step 3: 100 kbp中間体の合成

　Step 2と同様に，今度は10 kbpの中間体のうち，位置が連続するものを10種類まとめて酵母の中に導入し，組換えた*5．こうして，100 kbpの中間体11種（全体をカバーする）を作製した．10 kbpの中間体が正しく繋がったかどうかは，完成した産物の長さをチェックすることで確かめた．

Step 4: Mmゲノムの人工合成

　最後に，100kbpの中間体11種を酵母に入れて組換えることで，完成体の人工合成Mmゲノムを作製した．

　Step 4では，100 kbp中間体に混入していた酵母のゲノムDNAが，中間体の酵母への導入効率を大きく下げることが分かった．そこで，混入物を取り除くために，複数の方法で100 kbp中間体を精製*6したことが成功の鍵となった．

　このようにして作製したMmゲノムの中には，間違って繋がったものも含まれている．PCR法*7や制限酵素処理の切断パターン*8から，100 kbp中間体が目的通りに繋がった正しい「人工合成Mmゲノム」を選びとった．

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