相同DNA組換え依存するホモプラスミー成立機構とその普遍性
○柴田武彦、凌楓（理研・遺伝生化学）

目的：酵母でも、ヒトでもミトコンドリアゲノムの基本状態はホモプラスミーである。酵母細胞、哺乳類の生殖細胞系列では、ヘテロプラスミー状態は一過的で、少数世代間にホモプラスミーとなる。我々は、出芽酵母の相同DNA組換え欠損変異mhr1-1 及び、その野生型遺伝子がコードするMhr1蛋白質の研究から、ATP非依存型相同DNA対合蛋白質であるMhr1蛋白質が誘導するローリングサークル型複製でできる直鎖状多量体（コンカテマー）mtDNAが、発芽中の娘細胞への分配中間体であり、娘細胞に移ると同時に環状単量体にプロセスされるというモデルを提出した。このモデルは、ランダムに選ばれた少数のmtDNAの子孫だけを選択的に娘細胞へ送り込む結果になるので、ホモプラスミー成立機構を説明する。これらモデルを検証した。
結果：mhr1-1 変異は、mtDNAコンカテマーの量を減らし同時にヘテロプラスミックな接合体細胞からホモプラスミー細胞が分離する速度を遅らせた。一方、Mhr1蛋白質大量発現はmtDNAコンカテマー量を増加させ，同時にホモプラスミー化を加速した。これらの結果は、上記のmtDNA複製・分配のモデルと、ホモプラスミー化機構を支持する。更に、このモデルは細胞分裂周期をG1で同調した細胞でのmtDNAの選択的標識と、分裂開始後のmtDNA標識の追跡実験により確認された。
考察：多数のタンデムに連なる繰り返し配列に於いて、全ての単位配列が選択について中立である変異についても均一な集団になるというホモプラスミー化様現象は核染色体DNAでも知られている。興味深いことに、出芽酵母の核では、このような繰り返し配列の単位の増減は、DNA二本鎖切断の相同組換え修復に働く相同DNA対合蛋白質であるRad51蛋白質ではなく、ATPを必要としない相同DNA対合蛋白質Rad52蛋白に依存して起こることが知られている。従来は、繰り返し単位の増減は、不等交叉によって起こり、配列の均一化はジーンコンバージョンによって起こると言われていた。しかし、両者は、mtDNAの複製、ホモプラスミー化と共通な単一機構で説明できる。DNA二本鎖切断での、相同DNA対合蛋白質の作用結果が、ローリングサークル複製へ進むか、相同組換え修復へ進むかは、相同DNA対合反応という共通な開始機構とそこに働く相同DNA対合蛋白質の特性で決まるのかも知れない。

相同的組換えに依存するミトコンドリアDNAの複製開始と超抑圧現象
○凌楓1、堀晶子1,2、柴田武彦1
（1理研遺伝生化学、2埼大大学院理工）

　ミトコンドリアDNA (mtDNA)の遺伝機構には数多くの謎が秘められている。mtDNAの複製がどのように開始されたかについても未だに定説がない。哺乳類細胞のmtDNA複製の開始機構については、RNA polymerase による転写依存仮説を中心に研究が進められている。一方、単細胞真核生物である出芽酵母 Saccharomyces cerevisiae のmtDNA複製開始機構としては、転写依存型と組換え依存型の両方が議論されている。
最近我々は、出芽酵母において正常な mtDNA よりも優先的に複製されるという超抑圧現象（Hypersuppressiveness）を示す欠失mtDNAの複製原点 (Ori) 領域特異的な二本鎖切断が存在することを見出した。哺乳類細胞においても同様の事例が報告されているが、その生物学的な意義は不明である。一般に二本鎖切断において、切断端から生じる3ﾕ末端単鎖領域が無傷の二本鎖DNAの同じ、あるいは類似した塩基配列とヘテロ二本鎖を形成し、プライマーとして働き、相手のDNA鎖を鋳型としてDNA合成することで切断によって失われたDNA配列を回復する（相同的組換え修復）。出芽酵母mtDNA組換えに必須で、ローリングサークル型mtDNA複製開始にも働くMhr1蛋白質はヘテロ二本鎖を形成する活性を持つ。そこで、酵母ミトコンドリアではOri特異的な二本鎖切断がmtDNA複製開始に働き、単位長さ当たり多数のOriを持つ短い欠失mtDNAが超抑圧現象を引き起こすと考えられる。実際、二本鎖切断の強度が超抑圧現象を示す欠失mtDNA量の維持に関連し、またMhr1蛋白質の機能欠損がこのようなmtDNAからなるコンカテマー形成能と相同的組換え体に対する量の低下をもたらすことを見出した。これらは確かにOri特異的二本鎖切断がローリングサークル型複製開始に働くこと、更に、Mhr1蛋白質によるヘテロ二本鎖形成が二本鎖切断修復による相同的組換えの開始よりも優先的にローリングサークル複製誘導に機能することを意味する。また、二本鎖切断が組換え修復、あるいはローリングサイクル複製のどちらを誘導するかを制御する機構の存在が示唆される。

ミトコンドリアDNAの複製機構
○安川武宏、Mark Bowmaker Mingyao Yang、Aurelio Reyes & Ian Holt
(MRC DHNU, Hills Road, Cambridge, CB2 2XY, UK)

　哺乳動物ミトコンドリアDNA (mtDNA)は約16.5キロ塩基対（Kbp）の環状2本鎖DNAであり、その複製機構はそれぞれの鎖が互いに数Kbp離れた特定の位置（OH、OL）から別々に複製されるというモデルが提唱されコンセンサスを得ていた。このモデルはStrand-asymmetric型複製と呼ばれ哺乳動物mtDNAのみに見られる特徴的な機構と考えられていた。
　しかしながら、我々はDNA複製過程を正確に検証するために広く用いられているneutral/neutral 2次元電気泳動法（2DNAGE）を中心とした解析により、mtDNAはleading鎖とlagging鎖が協調的に新生されていくStrand-coupled 型複製で複製されていることを明らかにした。つまりmtDNAの複製機構は従来信じられてきたStrand-asymmetric型とは決定的に異なる、核やplasmidなどで見られる一般的なStrand-coupled型であるということを突き止めた。また、mtDNAは複製過程でリボヌクレオチドをDNA鎖に取り込んでいることも明らかにした。
　さらに我々は2DNAGEを用いてmtDNA上の複製開始場所を正確にマッピングしたところ、開始点はOHとOLではなく、cytochrome b(cyt b)、NADH dehydrogenase subunits 5、6 (ND5、ND6)の3つの遺伝子がコードされている約4 Kbpの領域にまたがった広い領域であることを明らかにした。この複製機構は本質的に両方向へ複製フォークが拡大していくbi-directional theta replicationであり、一方向の複製の進行はOHで停止し、それ以降はその逆方向のみに複製が進行している。
これらの結果はヒト、マウス、ラット、培養細胞で共通であったことから、哺乳動物や同等の大きさの環状2本鎖mtDNAを持つ生物のあらゆるmtDNAの複製は上記の機構を共有していると考えられる。

TFAMはミトコンドリアDNAの維持に必要である
○神吉智丈、大垣吉平、濱崎直孝、康東天
（九大・医・臨床分子医学）

要旨：我々は、transcription factor A (TFAM)が、ミトコンドリアDNA(mtDNA)１コピー当たり約1000分子存在すること、さらに、その全てがmtDNAと結合していることを明らかにし、核様体の主体は、mtDNAとTFAMの複合体であることを報告してきた。今回われわれは、ヒトHeLa細胞に於いて、tet-offシステムを用いたTFAMの過剰発現細胞を樹立した。組織染色で確認したところ、過剰発現したTFAMのほとんどがミトコンドリアに局在した。過剰発現状態ではコントロールに対し、TFAMがおよそ2倍発現し、同時にmtDNAも2倍に増加した。また、RNAiを用いたTFAM発現抑制実験では、TFAMは15%程度まで減少し、同時にmtDNAも10%程度まで減少した。さらに、TFAM過剰発現状態で、RNAiを用いて内在性TFAMの発現を抑制すると、内在性のTFAMは、15％程度まで減少するが、tet-offシステム由来のTFAMは減少せず、TFAMの総量は1.1〜1.5倍程度となった。このときmtDNAも同程度維持されていた。こうしたTFAMの増減に従いmtDNAも同程度増減するというこれらの結果は、TFAMがmtDNAの維持に重要な役割を果たしている事を強く示唆している。さらに、これらの過剰発現細胞もしくはRNAiによるTFA発現抑制細胞から精製してきたミトコンドリアを用いて転写活性を測定し、TFAMの過剰発現時、発現抑制時の転写に対する影響も観察中である。

8-oxodG修復におけるTFAMの役割
○福應温、Alam Tanfis Istiaq、濱崎直孝、康東天
（九大・医・臨床分子医学）

[背景・目的] mtDNAは細胞内でもっとも活性酸素が産生されているミトコンドリア内に存在しているため酸化傷害を受けやすい。DNAの酸化傷害として代表的な8-oxodGは塩基除去修復により修復されると考えられている。塩基除去修復は傷害特異的なDNAグリコシラーゼによる傷害塩基の除去によって始まり、すべてのDNAグリコシラーゼが持つAPエンドヌクレアーゼ活性により修復合成されるべきDNAのギャップを形成する。大腸菌ではMutMとMutYが、ヒトにおいてはhOGG1とhMYHがそれぞれ8-oxodG/dCペアの8-oxodGと8-oxodG/dAペアの dAを除去する。これまでにhOGG1とhMYHはmtDNAにおいても8-oxodGの修復に働くことが報告されている。我々はTFAMがmtDNAとnucleoid構造をとっていると考えているが、本研究ではTFAMが酸化傷害に対する塩基除去修復においてどのような役割果たしているかを明らかにする端緒として、それぞれのDNAグリコシラーゼの活性に対してTFAMがどのような作用をもつか検討した。
[方法・結果及び考察] 大腸菌MutMおよびMutYを用いた8-oxodG修飾したオリゴDNAに対するDNA鎖切断実験系にTFAMを加えたところ、TFAMがMutMとMutYどちらのAPエンドヌクレアーゼ活性に対しても阻害的に働くことが分かった。一方、我々は同じオリゴDNAを用いたEMSAにより、TFAMが8-oxodG修飾したオリゴDNAと結合することを確認している。これまでにも酸化傷害部位にTFAMが高い親和性を持つという報告がなされており、TFAMはMutMやMutYのヌクレアーゼ活性を基質拮抗的に阻害すると考えられる。本研究会では、hOGG1、hMYHに対するTFAMの作用も合わせて検討し、さらにそれぞれのDNAグリコシラーゼの8-oxodG修復に対するTFAMの効果を基質特異性の点から考察したいと考えている。