RASの発現を制御するlet-7 microRNAファミリー： 発生と癌化の関係

エール大学のDr. Frank Slack、Dr. Steven Johnson、Dr. Helge Grosshans、Ms. Kristy Reinertは、Ambionの研究者と共同研究を行ない、C. elegans の上皮細胞と陰門細胞においてlet-7 microRNA（miRNA）がlet-60/ RAS の発現を制御している事を発見した。こ の研究対象を広げて、ヒトの細胞でも行なった。科学雑誌「Cell 」の3月号に掲載された通り、let-7 miRNAはヒトのガン遺伝子である RASの発現を制御しており、ヒトの肺ガンを抑制することがある。ヒトの肺ガンにおけるlet-7 miRNAの減少とRASタンパク質の誘導の相関から、let-7 miRNAの制御のミスによるRASタンパク質の著しい高発現が、癌化の一因となると推測される。

C. elegans の発生過程においてlet-60/RAS を制御するlethal-7 (let-7 ) miRNA

C. elegans の表皮は主にseam、syncytial、Pの3種類の細胞タイプから作られる。seam cellにお けるlet-7 miRNAの一時的な高発現 [2-3]が、成熟期での分化の終結に必要である[3]。これらの 細胞は細胞周期から外れると、細胞同士が融合 しcuticular alae（線虫の側面にある縦方向の隆起した部分）を排泄する[4]。Dr. Frank Slackは let-7遺伝子ファミリーがどのように細胞の分化 に影響するかを調べるためにコンピューターを用いたアプローチを行ない、let-7 に相補的な配列（LCS）を少なくとも一つ含む、発生に関わる 11種類の遺伝子同定を試みた[1,5]。コーディング領域の3塩基のLCSだけでなく、3’UTR（3’非 翻訳領域）に8塩基のLCSと10塩基の一致しな い部位を持つlet-60/ RAS が、同定された遺伝子の中で際立っていた。C. elegansでの陰門の分化 におけるlet-60/ RAS の役割は詳しく特徴づけ されており[6]、発現の研究から、let-7 miRNAによるlet-60/RAS の一時的な制御がseam cellと陰門細胞の分化におけるlet-7 の役割 を少なくとも部分的に説明していることがわかる[1]。Johnsonらも遺伝学的アプローチと、

ヒトのlet-7とRAS遺伝子

let-60/ RAS はヒトのRAS遺伝子であるHRAS、 KRAS、NRASの、C. elegansオーソログである。 これら3種類全てのヒトRAS の3’UTRには、検証済みのC.legansのLCSの特徴である推定上の、let-7 に相補的な複数の部位が含まれている。 LCSの多くは、げっ歯類、両生類、魚類で保存されており、機能の関連が示唆されている。ヒトのRASの3’UTRにおいて推定上のLCSが存在するということは、C. elegansでのlet-7 とmiR-84によるlet-60/ RASの制御に類似して、哺乳動物の let-7 ファミリーに属する遺伝子がヒトのRAS を制御していると推測される。

ヒトの細胞におけるlet-7 によるRAS の発現制御

let-7 がヒトのRAS 遺伝子の発現を制御していることを確かめるため、培養細胞にlet-7 miRNAの前駆体と阻害物質をトランスフェクトして、RAS のタンパク質レベルを測定した。マイクロアレイ解析で検出できるレベルのlet-7 発現がないHepG2細胞に、siPORT™ NeoFX™ Transfection Agent (Cat #4511)を用いて、let-7 用のPre-miR™ miRNA Precursor Molecule (Cat#17100)をトランスフェクトした。導入された、let-7 用のPre-miR™ miRNA Precursor Molecule はmiRNAのパスウェイに入り、内在性のmiRNAにより制御されている遺伝子の発現に変化を与える。実験を3回行なったところ、let-7 miRNAレベルが上ることにより、ネガティブコントロール用のmiRNA（Pre-miR Negative Control #1 miRNA, Cat#17110）をトランスフェクトした細胞に比べてR A Sの発現が70% 減少した (Figures 1Aと1B)が、GAPDHとp21のタンパク質レベルには変化は無かった（データ未提示）。

Figure 1. let-7 Influences the Expression of RAS in Human Cells. HepG2 cells were transfected in 24 well plates using siPORT™ NeoFX™ (Ambion) with either 30 nM let-7a Pre-miR™ miRNA Precursor Molecule (Ambion) or a negative control miRNA inhibitor (A–B). HeLa cells were transfected in 24 well plates using Lipofectamine™ 2000 (Invitrogen) with either 30 nM let-7a Anti-miR™ miRNA Inhibitors (Ambion) or a negative control miRNA inhibitor (C–D). Three days post-transfection, RAS expression was monitored by immunofluorescence (A, C) and quantified using MetaMorph® software (Universal Imaging corporation) (B, D; triplicate assays). Modified with permission from Cell 120: 635–647.

miRNAを抑制する実験において、let-7a を高発現しているHeLa細胞に、let-7a に対する合成アンチセンスRNA（let-7a Anti-miR™ miRNA Inhibitor, Cat#17000）をトランスフェクトしたところ、let-7 の活性を阻害されるとRAS の発現は抑制されないという推測が事実であることが確かめられた（Figures 1Cと1D）。ネガティブコントロール用のmiRNAをトランスフェクトした細胞に比べて、let-7 に対する阻害分子をトランスフェクトした細胞ではRASタンパク質のレベルが70%高かった。これはヒトの細胞におけるRAS の発現に対して、let-7 が負の制御をしていることを示唆している。

3’UTRを介してヒトのRAS遺伝子ファミリーを制御するlet-7

NRAS の3’UTR（長さ3.5 kb で9つのLCSを含む） とKRAS の3’UTR（長さ1 kb で7つのLCSを含む） をルシフェラーゼのレポーター配列の下流にそれぞれサブクローニングした。HeLa細胞にトランスフェクトすると、インサート無しのコントロール用レポーターコンストラクトに比べて、RAS 3’UTRの入ったレポーターコンストラクトのルシフェラーゼ活性は1/4〜1/8だった（Figure 2A）。

Figure 2. let-7 Regulates NRAS and KRAS Through Their 3' UTRs. The NRAS 3'UTR (3.5 kb containing nine LCSs) and the KRAS 3'UTR (1 kb containing seven LCSs) were subcloned downstream of the luciferase reporter gene. The control plasmid did not contain any insert. HeLa cells were transfected in 12 well plates using Lipofectamine™ 2000 (Invitrogen) with the plasmids described. 24 h post-transfection, cells were harvested and assayed using the Dual-Luciferase® assay (Promega). (A) Fold induction of reporter gene activity was expressed relative to the negative control vector. (B) To show specificity of the interaction between let-7 and RAS 3' UTRs, similar experiments were performed with an additional cotransfection of let-7 miRNA inhibitors (let-7a Anti-miR™ miRNA Inhibitors [Ambion] or a negative control miRNA inhibitor [Ambion]). Modified with permission from Cell 120: 635–647.

この結果がHeLa細胞におけるlet-7 の発現に関係しているかを確認するために、ルシフェラーゼレポーターベクターをlet-7 miRNAの阻害物質あるいはネガティブコントロール用の阻害物質と共にコトランスフェクションした。Figure 2Bからわかるように、HeLa細胞におけるlet-7 活性の減少がレポーター遺伝子の発現を活性化した。このアッセイではネガティブコントロール用の阻害物質をトランスフェクトした細胞に比べて、 ルシフェラーゼ活性が2〜2.5倍に上がった。
RAS 3’UTRの複数の潜在的なLCSの同定に加えて、Figure 2のデータの通りlet-7 miRNAがRAS 3’ UTR を介してRAS の発現に関わっていることを示している。

ヒトの肺ガンにおけるlet-7

関連する研究プロジェクトにおいて、AmbionのmiRNAマイクロアレイテクノロジー（167種類のmiRNAプローブについては「高感度なmicroRNAのマイクロアレイの性能」参照）を用いて、IB期あるいはIIA期の扁平上皮ガン患者12人を含む21人のガン患者の組織におけるlet-7 の発現レベルを調べた。興味深いことに、同一患者から採取した正常サンプルに比べて、肺の腫瘍サンプルではlet-7 miRNAのレベルが50％以下だった（Figure 3A）。乳ガンと結腸ガンのサンプルではlet-7 の散在性の減少だけが検出された。これに類似した現象がTakamizawaらにより発見、報告されている[8]。さらにヒトのlet-7 ファミリーの複数の遺伝子が肺ガンで欠損しているchromosomal intervalにマッピングされており[9]、我々が観察したlet-7 発現の減少に対する説明が可能になる。

肺ガンにおけるlet-7 miRNA、RAS mRNA、RAS Protein

RAS ( HRAS、KRAS、NRAS )の発現のミスや変異はヒトのガンに関わっている[10-11]。今回観察された、(1) RAS がガン遺伝子であること、(2)肺ガンで let-7 が抑制されていること、(3) RAS の発現がlet-7 miRNAによって制御されていることの全てから、肺組織におけるlet-7 の減少がRAS の高発現を起こし、細胞の増殖が活発になると考えられる。今回の実験モデルから、肺ガンにおけるlet-7 miRNAとRAS タンパク質の発現は反比例すると推測される。

この仮説を確かめるために、mirVana™ PARIS™ Kit(Cat #1556)を用いて、3人の患者からそれぞれ採取した扁平上皮癌と正常組織からRNAとタンパク質の両方を分離し、同一サンプルにおけるRAS のタンパク質およびRNAレベル、let-7 miRNAレベルを測定した。全てのケースで腫瘍細胞におけるRASタンパク質のレベルは正常サンプルの少なくとも10倍で(Figure 3C,上図)、腫瘍におけるlet-7 miRNAレベルは正常サンプルの1/4〜1/8 であった(Figure 3C,中図)。この結果は、RAS のタンパク質の発現レベルが、肺におけるRAS mRNAよりもmiRNA発現レベルとの間に、より高い相関を持つことを示している。

Figure 3. let-7 is Poorly Expressed in Human Lung Tumors. (A) The mirVana™ miRNA Isolation Kit (Ambion) was used to isolate miRNA from 21 breast, colon, and lung tumors, as well as from associated normal adjacent tissue (NAT). Microarray analysis using 167 miRNA probes (mirVana miRNA Probe Set, Ambion) was used to examine let-7 miRNA expression profiles (tumor relative to NAT) in these samples. After labeling tumor miRNA samples with Cy™3 (Amersham) and NAT miRNA samples with Cy5 (mirVana miRNA Labeling Kit, Ambion), the microarray was hybridized for 14 h. Scanning was performed with the GenePix® 4000B (Axon) (B) Northern analysis was performed using paired RNA preparations from two of the patients from Figure 3A and a radiolabeled probe specific for let-7c and 5S rRNA (control). (C) The mirVana PARIS™ Kit (Ambion) was used to isolate protein and RNA from three additional pairs of tissues from lung cancer patients. Western blots were performed using antibodies specific for RAS (US Biological) or GAPDH (Ambion) (top). Northern blot analysis was performed using radiolabeled probes for let-7 and U6 snRNA (middle). NRAS and ß-actin mRNA, as well as 18S rRNA (for normalization) were quantified by real-time RT-PCR (bottom). Modified with permission from Cell 120: 635–647.

この研究からlet-7 miRNAが肺において腫瘍抑制の機能を果たしていると推測される。let-7 の制御のミスがRAS タンパク質の高発現を誘発し、癌化を引き起こす一因かもしれない。細胞性モデルでの迅速でパワフルなloss of functionとgain of functionの研究と、臨床サンプルでのmiRNAの発現プロファイルの解析を結合することによりmiRNA ファミリーメンバーの新しい重要な生物学的機能が確実に明らかになるであろう。

Scientific Contributors
Jaclyn Shingara, Mike Byrom, Rich Jarvis, Angie Cheng, Emmanuel Labourier, Kerri Keiger, Brian Cannon, Vince Pallotta, Sean Banks, David Brown • Ambion, Inc.

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