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【発明の名称】 臓器の機能不全又は変性に起因する疾患の治療剤
【発明者】 【氏名】水野 純子
【要約】 【課題】

【解決手段】一本鎖ＨＧＦを有効成分とする腎疾患治療剤、肝疾患治療剤、心疾患治療剤、尿細管細胞の増殖促進剤、糸球体の線維化抑制剤、及び傷害臓器特異的治療剤。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
一本鎖ＨＧＦを有効成分として含有することを特徴とする、臓器の機能不全または変性に起因する疾患の治療剤。
【請求項２】
一本鎖ＨＧＦがヒト、イヌ、ネコ、マウスまたはラット由来のＨＧＦである請求項１に記載の治療剤。
【請求項３】
臓器の機能不全または変性に起因する疾患が腎疾患である請求項１または２に記載の治療剤。
【請求項４】
腎疾患が急性腎不全または慢性腎不全である請求項３に記載の治療剤。
【請求項５】
腎疾患が、外傷、熱症、感染症、敗血症、溶血、虚血または薬剤等の中毒に起因する急性腎不全である請求項３に記載の治療剤。
【請求項６】
腎疾患が、糸球体腎炎、糖尿病性腎炎、尿細管腎炎、腎硬化症、嚢胞腎、慢性腎盂腎炎、悪性高血圧、ＳＬＥ、アミロイドーシスまたは痛風に起因する慢性腎不全である請求項３に記載の治療剤。
【請求項７】
臓器の機能不全または変性に起因する疾患が肝疾患である請求項１または２に記載の治療剤。
【請求項８】
臓器の機能不全または変性に起因する疾患が心疾患である請求項１または２に記載の治療剤。
【請求項９】
傷害臓器に特異的である請求項１〜８のいずれかに記載の治療剤。
【請求項１０】
一本鎖ＨＧＦを有効成分として含有することを特徴とする尿細管細胞の増殖促進剤。
【請求項１１】
一本鎖ＨＧＦを有効成分として含有する糸球体の線維化抑制剤。
【請求項１２】
一本鎖ＨＧＦを有効成分として含有する傷害臓器特異的治療剤。
【発明の詳細な説明】【技術分野】
【０００１】
本発明は臓器の機能不全または変性に起因する疾患の治療剤に関し、更に詳しくは一本鎖の肝細胞増殖因子（以下、ＨＧＦと略記する。）を有効成分とする疾患治療剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＨＧＦは、生体内で不活性型の一本鎖ＨＧＦとして合成された後、プロテアーゼによって活性化され、活性型の二本鎖ＨＧＦになる。一本鎖ＨＧＦは生物活性を有さないことから、二本鎖ＨＧＦへの変換は生物活性の発現には必須である。ＨＧＦを活性化させるプロテアーゼとしては血液中に含まれる、ＨＧＦアクチベータ（ＨＧＦＡ）やマトリプターゼ等が知られている。
一本鎖ＨＧＦは、生物活性は有さないが、レセプターであるｃ−Ｍｅｔに対する親和性は保持している（非特許文献１参照。）。このため、一本鎖ＨＧＦを投与すると、ＨＧＦアンタゴニストとして働き、ｃ−Ｍｅｔの活性化を阻害する。また、一本鎖ＨＧＦは、二本鎖ＨＧＦの活性も阻害する（非特許文献２参照。）。よって、ＨＧＦを投与して治療を行うには二本鎖ＨＧＦを用いることが望ましいと考えられていた。
【非特許文献１】ザ・イー・エム・ビー・オー・ジャーナル（The EMBO Journal）、１９９２年、第１１巻（第７号）、ｐ．２５０３−２５１０
【非特許文献２】ザ・ジャーナル・オブ・クリニカル・インベスティゲーション（The Journal of Clinical Investigation）、２００４年、第１１４巻（第１０号）、ｐ．１４１８−１４３２
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
本発明は、一本鎖ＨＧＦの新たな用途を開発することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明者らは、前記課題を解決すべく種々研究を重ねた結果、以下の知見を得た。
(i) 急性腎不全および慢性腎不全を誘発した動物に一本鎖ＨＧＦを投与すると、いずれの腎不全に対しても生理学的または病理学的に優れた治療効果を奏する。
(ii) 肝炎、肝硬変を初めとする肝臓疾患を誘発した動物に一本鎖ＨＧＦを投与すると、いずれの肝臓疾患に対しても優れた治療効果を奏する。
(iii) 心疾患を誘発した動物に一本鎖ＨＧＦを投与すると、いずれの心疾患に対しても優れた治療効果を奏する。
本発明は上記知見に基づき完成されたものであり、下記の治療剤を提供する。
項１． 一本鎖ＨＧＦを有効成分として含有することを特徴とする、臓器の機能不全または変性に起因する疾患の治療剤。
項２． 一本鎖ＨＧＦがヒト、イヌ、ネコ、マウスまたはラット由来のＨＧＦである項１に記載の治療剤。
項３． 臓器の機能不全または変性に起因する疾患が腎疾患である項１または２に記載の治療剤。
項４． 腎疾患が急性腎不全または慢性腎不全である項３に記載の治療剤。
項５． 腎疾患が、外傷、熱症、感染症、敗血症、溶血、虚血または薬剤等の中毒に起因する急性腎不全である項３に記載の治療剤。
項６． 腎疾患が、糸球体腎炎、糖尿病性腎炎、尿細管腎炎、腎硬化症、嚢胞腎、慢性腎盂腎炎、悪性高血圧、ＳＬＥ、アミロイドーシスまたは痛風に起因する慢性腎不全である項３に記載の治療剤。
項７． 臓器の機能不全または変性に起因する疾患が肝疾患である項１または２に記載の治療剤。
項８． 臓器の機能不全または変性に起因する疾患が心疾患である項１または２に記載の治療剤。
項９． 傷害臓器に特異的である項１〜８のいずれかに記載の治療剤。
項１０． 一本鎖ＨＧＦを有効成分として含有することを特徴とする尿細管細胞の増殖促進剤。
項１１． 一本鎖ＨＧＦを有効成分として含有する糸球体の線維化抑制剤。
項１２． 一本鎖ＨＧＦを有効成分として含有する傷害臓器特異的治療剤。
【発明の効果】
【０００５】
本発明の治療剤は、臓器の機能不全又は変性、特に腎不全のような腎疾患、肝疾患、心疾患等に対して優れた治療効果を奏する。腎疾患の治療においては、尿細管細胞の増殖を促進し、糸球体の線維化を抑制し得る。
また、本発明に使用される一本鎖ＨＧＦは、傷害臓器において活性型のＨＧＦとなり得るので、健常な臓器に影響を与えることなく、傷害臓器で治療効果を発揮し得る。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００６】
一本鎖ＨＧＦ
本発明で使用される一本鎖ＨＧＦは公知物質であり、医薬として使用できる程度に精製されたものであれば、種々の方法で調製されたものを用いることができる。一本鎖ＨＧＦとしては、例えばＮＣＢＩのデータベース等に登録されている登録番号Ｐ１４２１０（配列番号１）またはＮＰ＿００１０１０９３２（配列番号２）で表されるアミノ酸配列で示されるヒト由来ＨＧＦ；登録番号ＮＰ＿００１００２９６４（配列番号３）、ＢＡＣ５７５６０等で表されるアミノ酸配列で示されるイヌ由来ＨＧＦ；登録番号ＮＰ＿００１００９８３０（配列番号４）、ＢＡＣ１０５４５、ＢＡＢ２１４９９等で表されるアミノ酸配列で示されるネコ由来ＨＧＦ；登録番号ＡＡＢ３１８５５、ＮＰ＿０３４５５７（配列番号５）、ＢＡＡ０１０６５，ＢＡＡ０１０６４等で表されるアミノ酸配列で示されるマウス由来ＨＧＦ；または登録番号ＮＰ＿０５８７１３（配列番号６）等で表されるアミノ酸配列で示されるラット由来ＨＧＦ等が好ましく挙げられるが、これらに限定されない。配列番号１乃至６で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質は天然の一本鎖ＨＧＦであって、活性化されるとＨＧＦとしての遊走活性、形態形成活性等を有する。
【０００７】
一本鎖ＨＧＦは、活性化されてＨＧＦと実質的に同じ作用を有する限り、そのアミノ酸配列中の１若しくは複数個（例えば、約２〜２０個、好ましくは約２〜１０個；以下同様である。）のアミノ酸が置換、欠失若しくは付加されていてもよく、また同様に糖鎖が置換、欠失若しくは付加されていてもよい。そのような一本鎖ＨＧＦ、例えば上記した配列番号１で表されるアミノ酸配列と実質的に同一である一本鎖ＨＧＦとしては、例えば配列番号１で表されるアミノ酸配列の第１６１〜１６５番目の５個のアミノ酸残基が欠失している配列番号２で表される一本鎖ＨＧＦ（５アミノ酸欠損型ＨＧＦ）やＮＣＢＩのデータベースに登録されているAccession No．ＢＡＡ１４３４８またはＡＡＣ７１６５５等のヒト由来の一本鎖ＨＧＦ、あるいは上記したイヌ、ネコ、ラットまたはマウスの一本鎖ＨＧＦ等を挙げることができる。ここで、アミノ酸配列について、「１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加」とは、遺伝子工学的手法、部位特異的突然変異誘発法等の周知の技術的手段により、または天然に生じうる程度の数（１〜複数個）が、欠失、置換若しくは付加等されていることを意味する。糖鎖が置換、欠失若しくは付加した一本鎖ＨＧＦとは、例えば天然の一本鎖ＨＧＦに付加している糖鎖を酵素等で処理し糖鎖を欠損させた一本鎖ＨＧＦ、また糖鎖が付加しない様に糖鎖付加部位のアミノ酸配列に変異が施されたもの、あるいは天然の糖鎖付加部位とは異なる部位に糖鎖が付加するようアミノ酸配列に変異が施されたもの等をいう。具体的には、例えばＮＣＢＩのデータベースに登録されている登録番号ＮＰ＿００１０１０９３２のヒトＨＧＦに対し、糖鎖付加部位の２８９位ＡｓｎをＧｌｎに、３９７位ＡｓｎをＧｌｎに、４７１位ＴｈｒをＧｌｙに、５６１位ＡｓｎをＧｌｎに、６４８位ＡｓｎをＧｌｎにそれぞれ置換することによって糖鎖が付加しないようにしたＨＧＦ［Fukuta K et al., Biochemical Journal，388，555-562（2005）］等を挙げることができる。
さらに、一本鎖ＨＧＦのアミノ酸配列と少なくとも約８０％以上の相同性を有する蛋白質、好ましくは約９０％以上の相同性を有する蛋白質、より好ましくは約９５％以上の相同性を有する蛋白質であって、かつ活性化されるとＨＧＦと実質的に同質の活性を有する蛋白質も本発明に使用される一本鎖ＨＧＦに含まれる。上記アミノ酸配列について「相同」とは、蛋白質の一次構造を比較し、配列間において各々の配列を構成するアミノ酸残基の一致の程度の意味である。
【０００８】
本発明に用いられる一本鎖ＨＧＦは、Ｃ末端がカルボキシル基（−ＣＯＯＨ）、カルボキシラート［−ＣＯＯＭ（Ｍは金属を示す）］、アミド（−ＣＯＮＨ2）またはエステル（−ＣＯＯＲ）のいずれであってもよい。ここでエステルにおけるＲとしては、例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピルもしくはｎ−ブチル等のＣ１−６アルキル基、例えば、シクロペンチル、シクロヘキシル等のＣ３−８シクロアルキル基、例えば、フェニル、α−ナフチル等のＣ６−１２アリール基、例えば、ベンジル、フェネチル等のフェニル−Ｃ１−２アルキル基もしくはα−ナフチルメチル等のα−ナフチル−Ｃ１−２アルキル基等のＣ７−１４アラルキル基のほか、アセチルオキシメチル、ピバロイルオキシメチル等のＣ２−６アルカノイルメチル基等が用いられる。本発明で用いられる一本鎖ＨＧＦが、Ｃ末端以外にカルボキシル基またはカルボキシラートを有している場合、カルボキシル基またはカルボキシラートがアミド化またはエステル化されているものも本発明における一本鎖ＨＧＦに含まれる。この場合のエステルとしては、例えば上記したＣ末端のエステル等が用いられる。さらに、本発明に用いられる一本鎖ＨＧＦには、上記した蛋白質において、Ｎ末端のメチオニン残基のアミノ基が保護基（例えば、ホルミル基、アセチル等のＣ２−６アルカノイル基等のＣ１−６アシル基等）で保護されているもの、Ｎ末端側が生体内で切断され生成したグルタミル基がピログルタミン酸化したもの、分子内のアミノ酸の側鎖上の反応性基（例えば、−ＯＨ、−ＳＨ、アミノ基、イミダゾリル基、インドリル基、グアニジノ基等）が適当な保護基（例えば、ホルミル基、アセチル等のＣ２−６アルカノイル基等のＣ１−６アシル基等）で保護されているもの、あるいは糖鎖が結合したいわゆる糖蛋白質等の複合蛋白質等も含まれる。
【０００９】
本発明に用いられる一本鎖ＨＧＦは塩を形成していてもよい。塩としては、酸または塩基との生理学的に許容される塩が挙げられ、とりわけ生理学的に許容される酸付加塩が好ましい。この様な塩としては、例えば、無機酸（例えば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸等）との塩、あるいは有機酸（例えば、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、蓚酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸等）との塩等が挙げられる。
【００１０】
上記一本鎖ＨＧＦは、ＨＧＦを活性化させる酵素が含まれない環境、例えばＨＧＦを産生する初代培養細胞や株化細胞を血清を添加せずに培養し、培養上清等から分離、精製して一本鎖ＨＧＦを得ることができる。あるいは遺伝子工学的手法により一本鎖ＨＧＦをコードする遺伝子を適切なベクターに組み込み、これを適当な宿主細胞に挿入して形質転換し、この形質転換体を無血清状態で培養し、培養上清から目的とする組換え一本鎖ＨＧＦを分離すること等により得ることもできる。（例えば、特開平５−１１１３８３号公報、Biochem．Biophys．Res．Commun．1989年、第163巻，p．967等を参照）。上記の宿主細胞は特に限定されず、従来から遺伝子工学的手法で用いられている各種の宿主細胞、例えば大腸菌、酵母、麹菌、昆虫細胞、植物細胞または動物細胞等を用いることができる。或いは、バキュロウイルスをヨトウ蛾或いはカイコの幼虫或いはサナギに接種する方法を用いることができる（例えば、WO01/092332号公報記載の方法）。或いは、適当なベクターによりカイコ、植物等の体内にＨＧＦを活性化させる酵素を保有していない生物のゲノム遺伝子中にＨＧＦ遺伝子を組み入れ、得られたトランスジェニック生物の体液中等に発現させる方法なども用いることができる。
【００１１】
腎疾患
本発明において、「腎疾患」は、腎血流量低下をきたす全ての状態をいい、間質性腎炎を含む尿細管上皮傷害を受ける場合、小血管傷害を含む糸球体が傷害を受ける場合を含む。腎疾患としては、具体的には、例えば急性腎不全または慢性腎不全等が挙げられる。
【００１２】
急性腎不全は、さまざまな原因により間質を含む尿細管が傷害を受けて腎機能が数日ないし数週間の経過で腎臓の機能が急激に低下した状態をいい、その症状としては、通常、ＢＵＮやＣｒｅの上昇、電解質異常、アシド−シス、乏尿、血尿、尿中β２-マイクログロブリンの上昇、尿中ＮＡＧ（Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ）の上昇等が挙げられる。 急性腎不全の原因としては、例えば、外傷、熱症を含む大怪我やショック、感染症、敗血症、著しい溶血、虚血または薬剤の中毒等が挙げられる。外傷には、クラッシュ症候群等が含まれる。感染症には、腎盂腎炎や感染性間質性腎炎等が含まれる。溶血には、赤血球が血管内で異常に早く破壊されて早朝のヘモグロビン尿を特徴とする発作性夜間血色素尿症（ＰＮＨ）、不適合輸血または人工心肺使用時の溶血等が含まれる。薬剤としては、例えばβラクタム剤、アミノグリコシド、サイアザイド系利尿剤、ワーファリン、非ステロイド系消炎鎮痛剤等が挙げられる。また、薬剤には、塩化水銀等の重金属；メタノ−ル、四塩化炭素等の有機溶剤；パラコート等の農薬やその他の尿酸、造影剤、または蛇毒等が含まれる。
【００１３】
慢性腎不全は、数ヶ月から数年かけて徐々に進行した腎炎をいい、その症状としては、急性腎炎と同様であるが、一般にヒトでは血清Ｃｒｅ値が２ｍｇ／ｄＬ以上あるいはＢＵＮが２０ｍｇ／ｄＬ以上を持続しているものが挙げられる。また、イヌではＣｒｅ値が２ｍｇ／ｄＬ以上、ネコではＣｒｅ値が３ｍｇ／ｄＬ以上を維持しているものが挙げられる(インターナショナルレーナルインテレストソサイアティー；ＩＲＩＳの基準)。
慢性腎不全の原因としては、例えば、糸球体腎炎、糖尿病性腎炎、尿細管腎炎、腎硬化症、嚢胞腎、慢性腎盂腎炎、悪性高血圧、ＳＬＥ（systemic lupus erythematosus；全身性エリテマトーデス）等の免疫疾患、アミロイドーシスまたは痛風等が挙げられる。犬、猫については、免疫疾患とは別の機構にて慢性腎不全が発症すると考えられているが原因については十分解析されていない。
肝疾患
本発明において、「肝疾患」の種類は特に限定されない。その症状としては、肝臓の変性壊死、肝臓の炎症、肝臓の合成機能の低下、肝臓の代謝機能の低下、線維化、胆汁のうっ滞、虚血などが挙げられる。また、疾患名としては、慢性肝炎、急性肝炎、劇症肝炎、アルコール性肝炎、肝硬変症、薬剤性（毒物性を含む）肝障害、虚血による肝障害、ルポイド肝炎、脂肪肝、原発性肝臓癌、転移性肝臓癌、溶血性黄疸、閉塞性黄疸などが挙げられる。犬に関しては、中でも、先天性或いは後天性の門脈大静脈短絡症が知られており(Comparative Hepatolory 2005 Dec 7;4:7)、一本鎖ＨＧＦは、この治療に有効である。
心疾患
本発明において、「心疾患」の種類は特に限定されない。例えば、心不全；細菌性又は非細菌性の心内膜炎；僧帽弁口狭窄、僧帽弁閉鎖不全、大動脈弁口狭窄、大動脈弁閉鎖不全のような心臓弁膜症；急性心膜炎、慢性収縮性心膜炎のような心膜炎；心筋炎；狭心症；心筋梗塞；心臓性喘息；肺性心；突発性心筋症；心臓神経症などが挙げられる。犬の心疾患に関しては、線維化を伴う拡張性心筋症に対して一本鎖ＨＧＦは治療に有効である。また、犬に多い、憎帽弁閉鎖不全症に関しても、要因と考えられているコラーゲン線維の蓄積を抑制するため、一本鎖ＨＧＦは治療に有効である。
【００１４】
治療
本発明において、「治療」とは、臓器の機能不全や変性の症状を緩解、または完治させることをいう。
腎疾患の場合は、「治療」には、例えば、腎疾患における血液中の血中尿素窒素（以下、ＢＵＮと略記する。）やクレアチニン（以下、Ｃｒｅと略記する。）の上昇、電解質異常、アシドーシス、乏尿或いは多尿等を抑制または防止し、正常化させることが含まれる。また、該治療には、尿細管細胞が変性したり減少したりしている部位において、尿細管細胞を増殖促進させること等も包含される。従って、一本鎖ＨＧＦは尿細管細胞の増殖促進剤の有効成分としても使用できる。また、該治療には、糸球体が線維化されるのを抑制または防止すること等も包含され、これらの結果、糸球体濾過量の改善、尿細管での再吸収能の改善による尿比重の改善等の効果も含まれる。従って、一本鎖ＨＧＦは糸球体線維化抑制剤の有効成分としても使用できる。
肝疾患の緩解、または完治には、各肝疾患の診断に使用される自覚症状や検査値異常等の１又は２以上の正常化又は正常化傾向が含まれる。心疾患の緩解、または完治には、各心疾患の診断に使用される自覚症状や検査値異常等の１又は２以上の正常化又は正常化傾向が含まれる。
また前述したように、一本鎖ＨＧＦは正常臓器に影響を与えることなく、傷害臓器の機能不全又は変性を特異的に治療することから、一本鎖ＨＧＦを含む治療剤は傷害臓器特異的治療剤ともなり得る。この場合の、傷害臓器の治療、即ち当該臓器障害の緩解、または完治には、その臓器障害の診断に使用される自覚症状や検査値異常等の１又は２以上の正常化又は正常化傾向が含まれる。
剤型
【００１５】
本発明の治療剤を患者に投与する場合、その製剤は、種々の製剤形態、例えば液剤、固形剤等をとりうるが、一般的には一本鎖ＨＧＦのみを、またはそれを慣用の担体と共に注射剤、徐放性製剤（例えば、デポ剤）等に製剤されるのが好ましい。上記注射剤は、水性注射剤または油性注射剤のいずれでもよい。水性注射剤とする場合、公知の方法に従って、例えば、水性溶媒（注射用水、精製水等）に、医薬上許容される添加剤、例えば等張化剤（塩化ナトリウム、塩化カリウム、グリセリン、マンニトール、ソルビトール、ホウ酸、ホウ砂、ブドウ糖、プロピレングリコール等）、緩衝剤（リン酸緩衝液、酢酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、炭酸緩衝液、クエン酸緩衝液、トリス緩衝液、グルタミン酸緩衝液、イプシロンアミノカプロン酸緩衝液等）、保存剤（パラオキシ安息香酸メチル、パラオキシ安息香酸エチル、パラオキシ安息香酸プロピル、パラオキシ安息香酸ブチル、クロロブタノール、ベンジルアルコール、塩化ベンザルコニウム、デヒドロ酢酸ナトリウム、エデト酸ナトリウム、ホウ酸、ホウ砂等）、増粘剤（ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリビニルアルコール、ポリエチレングリコール等）、安定化剤（亜硫酸水素ナトリウム、チオ硫酸ナトリウム、エデト酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、アスコルビン酸、ジブチルヒドロキシトルエン等）またはｐＨ調整剤（塩酸、水酸化ナトリウム、リン酸、酢酸等）等を適宜添加した溶液に、一本鎖ＨＧＦを溶解した後、フィルター等で濾過して滅菌し、次いで無菌的な容器に充填することにより調製することができる。また適当な溶解補助剤、例えばアルコール（エタノール等）、ポリアルコール（プロピレングリコール、ポリエチレングリコール等）または非イオン界面活性剤（ポリソルベート８０、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油５０等）等をさらに配合してもよい。油性注射剤とする場合、油性溶媒としては、例えば、ゴマ油または大豆油等が用いられ、溶解補助剤として安息香酸ベンジルまたはベンジルアルコール等を配合してもよい。調製された注射液は、通常、適当なアンプルまたはバイアル等に充填される。注射剤中の一本鎖ＨＧＦ含量は、通常約０．０００２〜０．２ｗ／ｖ％、好ましくは約０．００１〜０．１ｗ／ｖ％に調製され得る。なお、注射剤等の液状製剤は、凍結保存または凍結乾燥等により水分を除去して保存するのが望ましい。凍結乾燥製剤は、用時に注射用蒸留水等を加え、再溶解して使用される。
【００１６】
また、本発明で用いられる一本鎖ＨＧＦは、生体分解性高分子と共に、徐放性製剤（例えばデポ剤）とすることもできる。一本鎖ＨＧＦは特にデポ剤とすることにより、投薬回数の低減、作用の持続性および副作用の軽減等の効果が期待できる。該徐放性製剤は公知の方法に従って製造することができる。本徐放性製剤に使用される生体内分解性高分子は、公知の生体内分解性高分子のなかから適宜選択できるが、例えばデンプン、デキストランまたはキトサン等の多糖類；コラーゲンまたはゼラチン等の蛋白質；ポリグルタミン酸、ポリリジン、ポリロイシン、ポリアラニンまたはポリメチオニン等のポリアミノ酸；ポリ乳酸、ポリグリコール酸、乳酸−グリコール酸共重合体；ポリカプロラクトン、ポリ−β−ヒドロキシ酪酸、ポリリンゴ酸、ポリ酸無水物またはフマル酸・ポリエチレングリコール・ビニルピロリドン共重合体等のポリエステル；ポリオルソエステルまたはポリメチル−α−シアノアクリル酸等のポリアルキルシアノアクリル酸；ポリエチレンカーボネートまたはポリプロピレンカーボネート等のポリカーボネート等が挙げられる。好ましくはポリエステル、更に好ましくはポリ乳酸または乳酸−グリコール酸共重合体である。ポリ乳酸または乳酸−グリコール酸共重合体を使用する場合、その組成比（ポリ乳酸または乳酸／グリコール酸）（モル％）は徐放期間によって異なるが、例えば徐放期間が約２週間ないし３カ月、好ましくは約２週間ないし１カ月の場合には、約１００／０乃至５０／５０が好ましい。該ポリ乳酸または乳酸−グリコール酸共重合体の重量平均分子量は、一般的には約５，０００乃至２０，０００が好ましい。ポリ乳酸または乳酸−グリコール酸共重合体は、公知の製造法、例えば特開昭６１−２８５２１号公報に記載の製造法に従って製造できる。生体分解性高分子と一本鎖ＨＧＦの配合比率は特に限定はないが、例えば生体分解性高分子に対して、一本鎖ＨＧＦが約０．０１〜３０ｗ／ｗ％が好ましい。
【００１７】
投与対象
本発明の治療剤は、ヒトのほか、ヒト以外の哺乳動物、例えば、イヌ、ネコ、ラット、マウス、フェレット、サル、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ウサギ、ハムスター、モルモット、チンパンジー等にも適用できる。特にヒトに好適に使用できる。心疾患の治療剤である場合は、犬のような動物にも特に有効である。
また、腎疾患の治療剤である場合は、各腎疾患に羅患している哺乳動物に投与するのが好ましく、尿細管細胞の増殖促進剤である場合は、尿細管細胞が変性又は減少している哺乳動物に投与するのが好ましく、糸球体の線維化抑制剤である場合は、糸球体が線維化しつつある哺乳動物又はその前段階である蛋白尿の症状を呈している哺乳動物、特に人や、動物では猫に投与するのが好ましい。
肝疾患の治療剤である場合は、各肝疾患に羅患している哺乳動物に投与するのが好ましく、心疾患の治療剤である場合は、各心疾患に羅患している哺乳動物に投与するのが好ましい。
治療方法
本発明の臓器の機能不全又は変性に起因する疾患の治療剤の投与方法としては、注射剤を皮下、筋肉、静脈注射などが挙げられる。腎疾患の治療に際しては、腎動脈局所注入するか、直接腎臓の糸球体に近い部位に注射するか、あるいは徐放性製剤（デポ剤）を腎臓の糸球体に近い部位に埋め込む方法も好ましく挙げられる。肝疾患の治療に際しては、点滴静脈注射の方法も好ましく挙げられる。心疾患の治療に際しては、カテーテルを用いた心臓への局所投与の方法も好ましく挙げられる。
また、投与量は、投与する動物の種類、剤形、疾患の程度または年齢、体重等に応じて適宜選択されるが、通常、1回当たり約１μｇ〜５００ｍｇ、好ましくは約１０μｇ〜１００ｍｇ、さらに好ましくは約５０μｇ〜１５ｍｇである。また、投与回数も剤形、疾患の程度または年齢等に応じて適宜選択され、１回投与とするか、ある間隔をおいて持続投与とすることもできる。持続投与の場合、投与間隔は１日１回から数ヶ月に１回でよく、例えば、徐放性製剤（デポ剤）による投与の場合は、数ヶ月に１回でもよい。
【実施例】
【００１８】
以下に試験例を用いて本発明を説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。なお、以下において各略号の意味は、次のとおりである。
ＢＵＮ：血中尿素窒素
Ｃｒｅ：クレアチニン
Ｃｃｒ：クレアチニンクリアランス
ＰＢＳ：リン酸緩衝生理食塩水
ＥＬＩＳＡ：酵素免疫測定法
ＴＧＦ−β１：Transforming growth factor-β１；腫瘍細胞増殖因子-β1
α−ＳＭＡ：α-smooth muscle actin ；α-平滑筋アクチン
ＢＣＡ：ビシンコニン酸
ＵＵＯ：Unilateral ureteral obstruction；片側尿管閉塞
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ：SDS-Polyachrylamide gelelectrophoresis；ドデシル硫酸ナトリウム・ポリアクリルアミドゲル電気泳動
ＰＶＤＦ：polyvinylidenedifluoride；ポリフッ化ビニリデン
ＨＲＰ：Horseradish Peroxidase；西洋ワサビ過酸化酵素
また、実施例における％は特に明記しない場合は質量％を示す。
【００１９】
[試験例１]
慢性型腎傷害モデルネコに対する一本鎖ＨＧＦの効果
１．方法
（１）被験物質
被験物質としては、特開２００５‐１７０８３５号公報記載の方法で調製した組換えネコ一本鎖ＨＧＦ(以下、ネコＨＧＦと略記する。)を８０μｇ／ｍＬ濃度となるよう０．１５Ｍ塩化ナトリウムおよび０．０１％ツイーン８０を含有する１０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ６．０）で溶解した溶液（ネコＨＧＦ溶液という。）を使用した。
プラセボとして、０．１５Ｍ塩化ナトリウムおよび０．０１％ツイーン８０を含有する１０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ６．０）を使用した。
（２）供試動物
供試動物は、臨床および血液学的に異常所見が認められないことを確認した１０カ月齢以上の雑種雄ネコ１２頭を用いた。試験開始前（モデル作出前）の健常時体重は４．３８±０．４０ｋｇであった。供試動物は、温湿度を管理したクリーンルームで、個体ごとに代謝ケージ内で飼育した。給餌は１日１回の制限給餌とし、「アイムス・チキン」（アイムスジャパン株式会社製）５０ｇを給餌した。給水は水道水を自由摂取させた。
【００２０】
（３）腎傷害の作出
腎傷害の作出は、ゲンタマイシン（動物用ゲンタミン注射液、日本全薬工業）を動物の背部皮下に、１日１回、１週間に５日間連日投与することにより実施した。１回投与量は常用量（４ｍｇ／ｋｇ）の７．５倍用量（３０ｍｇ／ｋｇ）から開始して１１．２５倍用量まで漸増した。ゲンタマイシンの投与は、原則として１週間に１回の割合で実施する血液検査結果のうち、ＢＵＮ濃度が５０ｍｇ／ｄＬ以上およびＣｒｅ濃度が３ｍｇ／ｄＬ以上を示した時点で個体ごとに終了した。なお、血液検査は、ディスクリート方式臨床化学自動分析装置（シンクロンＣＸ４デルタシステム；ベックマン・コールター製）を用いて、ＢＵＮはＵＶレート法で、Ｃｒｅはレートヤッフェ法にて行った。
次いで、被験物質投与開始時の基準（以下、供試基準という）を表１の通り設定した。
【００２１】
【表１】


１）尿および血清Cre、尿量、体重をもとに以下の数式によりCcrを算出した。
Ccr（mL/min/kg）＝（尿Cre×尿量）/（血清Cre×1440×体重）
２）デジタル臨床屈折計（SU-202、シー・アイ・エス）を用いて尿比重を測定した。
【００２２】
ゲンタマイシンの投与終了後は原則として３週間の観察および検査を行い、各供試ネコにおける腎傷害の病態が供試基準を満たした状態で安定しているかを確認し、被験物質投与開始時点（０ｄ）の指標値のうちＣｒｅ値をもとに６頭ずつ、以下の２群に区分した。
ＨＧＦ群（ｎ＝６）：ネコＨＧＦを１日２回、連続１４日間、静脈内投与する群
対照群（ｎ＝６）：プラセボを１日２回、連続１４日間、静脈内投与する群
【００２３】
（４）被験物質の投与
ＨＧＦ群はネコＨＧＦ溶液を０．５ｍＬ／ｋｇ（ネコＨＧＦ４０μｇ／ｋｇ）の用量で、対照群はプラセボを０．５ｍＬ／ｋｇ用量でそれぞれ１日２回（９時と１６時）、連続１４日間（０ｄ−１３ｄ）静脈内投与した。
【００２４】
（５）臨床所見
試験期間中、各個体の臨床所見（食欲）を観察し、表２の基準に従ってスコア化（スコア０−４）した。また、試験期間中は毎日、薬剤投与前に各個体の体重を測定した。測定値から、各群の平均値±標準偏差を算出した。臨床所見スコアは、０ｄを基準とした経時的変化についてMann-Whitney検定を用いてそれぞれ検討した。
体重の群内変動は、０ｄを基準とした各時点との差についてDunnett検定を行った。
【００２５】
【表２】


【００２６】
（６）血清Ｃｒｅの測定
ゲンタマイシン投与期間中は原則として１週間に１回の割合で、被験物質投与期間中およびゲンタマイシン投与終了後は、０ｄ（投与開始前）、３ｄ（投与開始４日目投与前）、７ｄ（投与開始８日目投与前）、１０ｄ（投与開始１１日目投与前）および１５ｄ（投与中止２日目）に血液のサンプリングを行った。
血液のサンプリングは、各個体の所見等の観察終了後に各供試ネコの頚静脈より血液を約３ｍＬ採取し、３０００ｒｐｍで、１５分間、遠心分離して血清を分離し、血清Ｃｒｅを測定した。血清Ｃｒｅは、ディスクリート方式臨床化学自動分析装置（シンクロンＣＸ４デルタシステム；ベックマン・コールター製）を用いて、レートヤッフェ法にて測定した。
血清Ｃｒｅの変化については、０ｄを基準値として各時点の値を基準値で除した相対値として表し、それぞれの時点における両群間の差についてTukey検定を用いて検討した。
【００２７】
（７）尿比重の測定
ゲンタマイシン投与期間中は原則として１週間に１回の割合で、被験物質投与期間中およびゲンタマイシン投与終了後は、０ｄ（投与開始前）、３ｄ（投与開始４日目投与前）、７ｄ（投与開始８日目投与前）、１０ｄ（投与開始１１日目投与前）および１５ｄ（投与中止２日目）に尿のサンプリングを行った。
尿のサンプリングは、各個体の所見等の観察終了後に各供試ネコの２４時間排泄尿として自然排泄された尿を各代謝ゲージ下に設置したガラス製三角フラスコに貯留させて採取し、尿量はメスシリンダーを用いて測定し、尿比重は、デジタル臨床屈折計(SU-202 シー・アイ・エス株式会社製)を用いて測定した。
尿比重の変化については、０ｄを基準値として各時点の値を基準値で除した相対値として表し、それぞれの時点における両群間の差についてTukey検定を用いて検討した。
【００２８】
２．結果
（１）腎傷害の作出および区分
各群の０ｄにおける供試基準は、それぞれ対照群でＢＵＮ８０．１±２１．６ｍｇ／ｄＬ、Ｃｒｅ５．２±１．５ｍｇ／ｄＬ、内因性Ｃｃｒ０．６０±０．１３ｍＬ／ｍｉｎ／ｋｇおよび尿比重１．０２３±０．００５、ＨＧＦ群でＢＵＮ９２．０±４４．１ｍｇ／ｄＬ、Ｃｒｅ５．３±１．９ｍｇ／ｄＬ、内因性Ｃｃｒ０．６９±０．２８ｍＬ／ｍｉｎ／ｋｇおよび尿比重１．０２１±０．００４であった。これらの指標値について両群は等しい分散（Ｆ検定ｐ＜０．０５）を示す同等な集団（ｔ検定ｐ＜０．０５）であった。
【００２９】
（２）体重の変化
両群共に有意な体重の経時的変化は認められなかった。
（３）臨床所見
食欲スコアの結果を表３に示す。対照群では、有意な食欲の経時的変化が認められなかったのに対し、ＨＧＦ群では経時的に有意な食欲の増加が認められた。
【００３０】
【表３】


【００３１】
（４）血清Ｃｒｅ
結果を図１に示す。血清Ｃｒｅの相対値は、対照群に比較してＨＧＦ群では低値を示し、１５ｄにおけるＣｒｅ相対値は、対照群が０．８２±０．０９であったのに対し、ＨＧＦ群では０．７１±０．１２と減少が認められた（図１）。
【００３２】
（５）尿比重
結果を図２に示す。尿比重相対値は、対照群が減少から不変であったのに対し、ＨＧＦ群ではあきらなか増加を示し、１５ｄにおける尿比重相対値は、対照群が０．９９９７±０．００３３であったのに対し、ＨＧＦ群では１．０１０１±０．００７２と優位な増加が認められた（図２）
【００３３】
[試験例２]腎組織線維化に対する一本鎖ＨＧＦの効果
１．方法
（１）被験物質
被験物質としては、組換えネコ一本鎖ＨＧＦ（以下、ネコＨＧＦと略記する。）を８０μｇ／ｍＬ濃度となるよう０．１５Ｍ塩化ナトリウムおよび０．０１％ツイーン８０を含有する１０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ６．０）で溶解した溶液（ネコＨＧＦ溶液という。）を使用した。
プラセボとして、０．１５Ｍ塩化ナトリウムおよび０．０１％ツイーン８０を含有する１０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ６．０）を使用した。
（２）ＵＵＯモデルネコ
１０カ月齢以上の雑種雄ネコの左尿管を結紮してＵＵＯモデルネコを作出し、ネコＨＧＦ溶液投与群（以下、ＨＧＦ群という。）とプラセボ投与群（以下、対照群という。）に区分けした。
【００３４】
（３）線維化関連因子の測定
ＨＧＦ群には、ＵＵＯモデルネコ作出（尿管結紮）翌日よりネコＨＧＦ溶液を０．５ｍＬ／ｋｇ（ネコＨＧＦ４０μｇ／ｋｇ）を１日２回、６日間静脈内投与した。対照群には、尿管結紮翌日よりプラセボを０．５ｍＬ／ｋｇ用量で１日２回、６日間静脈内投与した。ネコＨＧＦ溶液またはプラセボを６日間投与後、各ＵＵＯモデルネコから腎組織（水腎を呈した左腎）を摘出した。摘出した腎組織は液体窒素により凍結し、試験に供するまで−８０℃で保管した。保管した腎組織を、Ｍｉｚｕｎｏ．Ｓらの方法（Kidney Int. 2001 Apr;59(4):1304-14）に準じてそれぞれＰＢＳと共にホモジナイズ、遠心分離し、得られた上清をサンプルとした。各サンプルについて、線維化関連因子として、ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−βリセプター１、フィブロネクチンおよびα−ＳＭＡを測定した。線維化関連因子のうち、ＴＧＦ−β１はＥＬＩＳＡにより測定し、ＴＧＦ−βリセプター１、フィブロネクチン、α−ＳＭＡならびにマーカーとなるアクチンについてはウエスタンブロッティングにより測定した。
【００３５】
ＥＬＩＳＡは、まず、ＢＣＡ法（BCA kit；PIERCE社製；570nm）による蛋白濃度測定によりＥＬＩＳＡに供するサンプルの総蛋白濃度を測定した後にＴＧＦ−β１測定用ＥＬＩＳＡ ｋｉｔ（BIOSOURCE社製）を用いてＴＧＦ−β１レベルを測定した。
得られたデータを蛋白１ｍｇあたりの量として算出し、それらについて群間の差について統計学的解析（Tukey法、p<0.05）を実施した。
【００３６】
ウエスタンブロッティングは、まず１０％ＳＤＳポリアクリルアミドゲルを用いた電気泳動によりサンプル中の蛋白を分離した。電気泳動時の添加サンプルは蛋白濃度０．０６ｍｇ／レーンで統一し、１レーン目は分子量マーカーを添加した。電気泳動後、メンブレン（ＰＶＤＦ膜）に転写した。転写終了後、分子量マーカー部分とサンプル部分の境界でメンブレンを切断し、両者を５％スキムミルク／ＰＢＳにてブロッキングを１時間行った。次いで、サンプル部分のメンブレンについて、一次抗体および二次抗体を用いて抗体染色を行った。一次抗体は３時間、二次抗体は１時間の反応を行い、抗体変更時は洗浄液（０．０００５％ツイーン２０添加ＰＢＳ）にて３回洗浄した。マーカー部分のメンブレンについては、ブロッキング後に洗浄液にて３回洗浄後、ＨＲＰ（Precision Strep Tactin-HRP Conjugate(IORAD社製）による反応を行った。すべての作業は室温下で実施した。染色後のメンブレンを洗浄液にて３回洗浄した後に発光基質（ECL Protein Biotinylation Module；GEヘルスケアバイオサイエンス社製）を吸着させ、ルミノメーター（Light-Capture；ATTO社製）を用いて各バンドを検出した。それぞれの検出バンドについて画像解析ソフト（CS Analyzer；ATTO社製）により質量解析を行った。なお、ＴＧＦ−β１の一次抗体としてはAnti TGF-β1 SC-398（サンタクルズ社製）を用い、フィブロネクチンの一次抗体としてはAnti fibronectin BD-610077（Pharmingen(アステラス製薬)製）を用い、α−ＳＭＡの一次抗体としてはAlpha-smooth Muscle antibody M0851（DAKO社製）を用いた。また、二次抗体としてはHRP標識抗マウスIgG抗体（コスモバイオ社製）を用いた。
【００３７】
（４）データ解析
各サンプルのＴＧＦ−βリセプター１、フィブロネクチンおよびα−ＳＭＡレベルはそれぞれをアクチンレベルで相対化（各値をアクチンレベルで除して算出）した量として算出した。得られたデータは各群における平均値±標準偏差を算出し、群間の差について統計学的解析（Tukey法、ｐ＜０．０５）を実施した。
【００３８】
２．結果
本試験における結果を表４に示した。尿管結紮後に腎線維化過程をたどるＵＵＯモデルネコに対してネコＨＧＦを全身的に投与したＨＧＦ群では対照群と比較して腎臓のＴＧＦ−β１レベルは低値を示した。同様に、腎組織中のＴＧＦ−βリセプター１レベルもネコＨＧＦを投与したＨＧＦ群で対照群よりも低値を示した。このことは、ネコＨＧＦ投与によりＴＧＦ−β１の発現および細胞膜に存在するＴＧＦ−β受容体の発現が抑制されるものと思われた。またＨＧＦ群では対照群よりも腎組織中のフィブロネクチンおよびα−ＳＭＡレベルが低値を示し、ネコＨＧＦを投与することにより腎線維化の進行が抑制された。これらの結果から、ネコＨＧＦは傷害腎に対して腎線維化抑制効果を有することが判明した。
【００３９】
【表４】


【００４０】
[参考例] カイコ虫体での組み換えネコＨＧＦの生産
ネコ白血球由来ｃＤＮＡを鋳型としてＷＯ０１／０９２３３２の実施例１（ｃ）に従ってＰＣＲおよびクローニングを行い、プラスミドＤＮＡを得た。得られたプラスミドＤＮＡをＷＯ０１／０９２３３２の実施例３に従って、片倉工業株式会社Ｓｕｐｅｒｗｏｒｍサービスにより、ｆＨＧＦおよびｄｆＨＧＦをコードするＤＮＡで組み換えられた組み換えバキュロウイルスを得た。得られた組み換えウイルスのウイルス液をカイコ虫体に投与し、数日間飼育の後、カイコ虫体体液を回収した。得られたカイコ虫体体液を特開２００５−１７０８３５の実施例に従って精製し、組換えネコ一本鎖ＨＧＦとして上記試験で用いた。
なお、得られた組換えネコ一本鎖ＨＧＦを常法に従い、ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動の後、ウェスタンブロッティング解析を行い、分子量約８．５万の位置に組み換えｆＨＧＦ蛋白を確認した。また、得られた組換えネコ一本鎖ＨＧＦについて、ＷＯ０１／０９２３３２の実施例４に従って血清９％添加ＤＭＥＭ培地においてＭＤＣＫ細胞を培養することで血清中のＨＧＦの活性化酵素の作用により一本鎖から活性型に変換されたＨＧＦの生物活性の測定を行い、ＨＧＦ活性を有することを確認した。
【産業上の利用可能性】
【００４１】
本発明の治療剤または発病抑制剤は、腎疾患、とりわけ腎不全の治療のための薬剤として有用である。また、肝疾患や心疾患の治療のための薬剤としても有用である。さらに、臓器を問わず、障害を受けた臓器だけを特異的に治療するための薬剤としても有用である。
【図面の簡単な説明】
【００４２】
【図１】図１は、慢性型腎傷害モデルネコにおける血清Ｃｒｅの相対値の経時変化を示す図である。図中ｄは日を示す。
【図２】図２は、慢性型腎傷害モデルネコにおける尿比重の相対値の経時変化を示す図である。図中ｄは日を示す。
【出願人】 【識別番号】５９１２８１２２０
【氏名又は名称】日本全薬工業株式会社
【識別番号】５０２０６８９０８
【氏名又は名称】クリングルファーマ株式会社
【識別番号】５０７０４４１１４
【氏名又は名称】有限会社スリーピー
【出願日】 平成１９年２月９日（２００７．２．９）
【代理人】 【識別番号】１０００７７０１２
【弁理士】
【氏名又は名称】岩谷 龍
【公開番号】 特開２００８−１９５６２８（Ｐ２００８−１９５６２８Ａ）
【公開日】 平成２０年８月２８日（２００８．８．２８）
【出願番号】 特願２００７−３０１４２（Ｐ２００７−３０１４２）